益心方调控SIRT1/PGC⁃1α信号通路改善大鼠心肌缺血再灌注损伤

董莉; 杨燕玲; 郑钰凡; 戎靖枫

doi:10.16305/j.1007-1334.2023.2210071

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益心方调控SIRT1/PGC⁃1α信号通路改善大鼠心肌缺血再灌注损伤

实验研究 | 更新时间：2023-07-15

- 益心方调控SIRT1/PGC⁃1α信号通路改善大鼠心肌缺血再灌注损伤
- Yixin Formula modulates SIRT1/PGC⁃1α signaling pathway to improve myocardial ischemia⁃reperfusion injury in rats
- 角色： First author , 第一作者 ,
  
  机构：
  上海中医药大学附属曙光医院心血管内科（上海 201203）
  上海中医药大学附属曙光医院心血管病研究室（上海 201203）
  
  邮箱：
  
  简介：董莉，女，硕士研究生，主要从事中西医结合治疗心肌缺血再灌注损伤的研究工作
  
  暂无本作者相关信息
  董莉
  ，
  角色：
  
  机构：
  上海中医药大学附属曙光医院心血管内科（上海 201203）
  上海中医药大学附属曙光医院心血管病研究室（上海 201203）
  
  邮箱：
  
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  杨燕玲
  ，
  角色：
  
  机构：
  上海中医药大学附属曙光医院心血管内科（上海 201203）
  
  邮箱：
  
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  郑钰凡
  ，
  角色： Corresponding author , 通讯作者 ,
  
  机构：
  上海中医药大学附属曙光医院心血管内科（上海 201203）
  上海中医药大学附属曙光医院心血管病研究室（上海 201203）
  
  邮箱： anastacia@126.com
  
  简介：戎靖枫，主任医师，硕士研究生导师； E-mail：anastacia@126.com
  
  暂无本作者相关信息
  戎靖枫
  ，
- 上海中医药杂志 2023年57卷第7期页码：58-65
- 作者机构：
  
  1.上海中医药大学附属曙光医院心血管内科（上海 201203）
  2.上海中医药大学附属曙光医院心血管病研究室（上海 201203）
- 作者简介：
  
  董莉，女，硕士研究生，主要从事中西医结合治疗心肌缺血再灌注损伤的研究工作
  戎靖枫，主任医师，硕士研究生导师； E-mail：anastacia@126.com
- 基金信息：
  
  上海市卫健委科研计划项目(202240225)
- DOI：10.16305/j.1007-1334.2023.2210071
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董莉,杨燕玲,郑钰凡,等.益心方调控SIRT1/PGC⁃1α信号通路改善大鼠心肌缺血再灌注损伤[J].上海中医药杂志,2023,57(7):58-65.

DONG Li,YANG Yanling,ZHENG Yufan,et al.Yixin Formula modulates SIRT1/PGC⁃1α signaling pathway to improve myocardial ischemia⁃reperfusion injury in rats[J].Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine,2023,57(7):58-65.
董莉,杨燕玲,郑钰凡,等.益心方调控SIRT1/PGC⁃1α信号通路改善大鼠心肌缺血再灌注损伤[J].上海中医药杂志,2023,57(7):58-65. DOI： 10.16305/j.1007-1334.2023.2210071.

DONG Li,YANG Yanling,ZHENG Yufan,et al.Yixin Formula modulates SIRT1/PGC⁃1α signaling pathway to improve myocardial ischemia⁃reperfusion injury in rats[J].Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine,2023,57(7):58-65. DOI： 10.16305/j.1007-1334.2023.2210071.

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摘要

目的

探讨中药复方益心方改善心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用及其机制。

方法

将60只清洁级Wistar大鼠随机分为4组，即假手术组、心肌缺血再灌注组（模型组）、益心方预处理+心肌缺血再灌注组（益心方组）、益心方预处理+心肌缺血再灌注+ 沉默信息调节因子1（SIRT1）抑制剂组（益心方+抑制剂组），每组15只。各组大鼠适应性喂养7 d后，益心方组和益心方+抑制剂组给予益心方（10 mL/kg）灌胃7 d，其余各组灌胃等体积的质量分数为0.9%的氯化钠溶液。术前3 d及术前20 min，益心方+抑制剂组尾静脉注射SIRT1抑制剂sirtinol（2 mg/kg），其余各组尾静脉注射等体积的质量分数为0.9%的氯化钠溶液。假手术组只穿线不结扎；其余各组结扎冠状动脉左前降支30 min，建立心肌缺血损伤模型，术中观察心电图变化情况。再灌注后检测心电图，观察再灌注模型是否建立成功；采用超声心动图和血流动力学检测评价各组大鼠的心功能；苏木精-伊红（HE）染色法观察心肌组织病理形态学的变化；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法测定心肌梗死面积；原位末端转移酶标记技术（TUNEL）法检测心肌细胞凋亡指数；生化法检测各组大鼠血清中的肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）水平；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H₂O₂）活性；免疫组织化学法和Western blot法检测SIRT1、过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子-1α（PGC-lα）、B淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（Bax）表达情况。

结果

①与假手术组比较，模型组大鼠心电图ST段明显抬高，表明大鼠心肌缺血模型建立成功；超声心动图和血流动力学检测显示，模型组大鼠左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室收缩压（LVSP）、左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax）降低，左心室舒张末压（LVDP）、左心室内压最大下降速率（-dp/dtmax）升高（P<0.05）；TTC染色结果显示，模型组大鼠心肌梗死面积增加（P<0.05）；生化检测结果显示，模型组大鼠血清中CK、LDH、MDA、H₂O₂水平升高，SOD水平降低（P<0.05）；免疫组织化学法和Western blot检测结果显示，模型组大鼠心肌组织中Bcl-2、SIRT1、PGC-1α表达下降，Bax表达升高（P<0.05）。②与模型组比较，益心方组心肌梗死的面积减少，LVEF、LVFS、LVSP、+dp/dtmax升高，LVDP、-dp/dtmax降低，左心室射血量增加，心功能改善（P<0.05）；血清CK、LDH、MDA、H₂O₂水平降低， SOD水平升高（P<0.05）；心肌组织中Bcl-2、SIRT1、PGC-1α表达升高，Bax表达降低（P<0.05）。③与益心方组比较，益心方+抑制剂组大鼠血清CK、LDH、MDA、H₂O₂水平升高，SOD水平降低（P<0.05）；心肌组织中Bcl-2、SIRT1、PGC-1α表达降低、Bax表达升高（P<0.05）。

结论

益心方预处理能够减轻氧化应激损伤和细胞凋亡，改善心肌缺血再灌注损伤，其作用机制可能与调控SIRT1/PGC-1α信号通路相关。

Abstract

Objective

To observe the effect of Traditional Chinese medicine compound Yixin Formula（YXF） to improve myocardial ischemia-reperfusion injury（MIRI）in rats and its mechanism.

译

Methods

Sixty clean-grade Wistar rats were randomly divided into four groups： sham-operated group， myocardial ischemia-reperfusion group （model group）， Yixin Formula+myocardial ischemia-reperfusion group （YXF group）， Yixin Formula+myocardial ischemia-reperfusion+SIRT1 inhibitor group （YXF+inhibitor group）， 15 rats in each group. After adaptive feeding of rats in each group for 7 d， YXF and YXF + inhibitor groups were given YXF 10 mL/kg by gavage for 7 d， and the remaining groups were given an equal volume of 0.9% sodium chloride solution by gavage. Three days and 20 min before surgery， an inhibitor of SIRT1， sirtinol（2 mg/kg）， was injected into the tail vein of rats in the YXF + inhibitor group， and an equal volume of 0.9% sodium chloride solution was injected into the tail vein of rats in the other groups. The sham-operated group was only threaded without ligation， while the left anterior descending branch of the coronary artery was ligated for 30 min in the remaining groups to establish a model of myocardial ischemic injury， and the changes of ECG were observed during operation. After reperfusion， ECG was examined to observe whether the reperfusion model was successfully established， and echocardiography and hemodynamics were used to examine the cardiac function of rats in each group. HE staining was used to observe the histomorphological changes of myocardial tissue. TTC staining was used to determine the area of myocardial infarction. TUNEL method was used to detect the apoptosis rate of myocardial cells. The biochemical method was used to detect the levels of CK and LDH in the serum of rats in each group. ELISA was used to detect the levels of SOD， MDA and H₂O₂in the serum of rats in each group. The protein expression of SIRT1， PGC-lα， Bcl-2 and Bax was detected by immunohistochemistry and Western blot.

译

Results

① Compared with the sham-operated group， the ST segment of the ECG was significantly elevated in the model group， indicating that the rat myocardial ischemia model was successfully established. Echocardiography and hemodynamic tests showed that LVEF， LVFS， LVSP， +dp/dtmax were decreased and LVDP， -dp/dtmax were increased in the model group （P<0.05）. TTC staining showed that the myocardial infarct area was increased in the model group （P<0.05）. The biochemical results showed that the serum levels of CK， LDH， MDA， and H₂O₂ were increased， and the level of SOD was decreased in the model rats （P<0.05）. The immunohistochemical and Western blot results showed that the expressions of Bcl-2， SIRT1 and PGC-1α proteins were decreased， and Bax expression was increased in the myocardial tissue of the model rats （P<0.05）. ② Compared with the model group， the YXF could reduce the area of myocardial infarction. The levels of LVEF， LVFS， LVSP， +dp/dtmax were increased， the levels of LVDP， -dp/dtmax were decreased， the left ventricular ejection volume was increased， and the cardiac function was improved in the YXF group （P<0.05）. The levels of CK， LDH， MDA， H₂O₂ were decreased and the level of SOD was increased in the YXF group. The expressions of Bcl-2， SIRT1 and PGC-1α in myocardial tissues of the rats were increased， and the expression of Bax was decreased in the YXF group （P<0.05）. ③ Compared with the YXF group， the CK， LDH， MDA， and H₂O₂ levels increased and SOD level decreased in the YXF + inhibitor group （P<0.05）. The expressions of Bcl-2， SIRT1， and PGC-1α were decreased and the expression of Bax was increased in the myocardial tissues of the YXF+inhibitor group （P<0.05）.

译

Conclusion

YXF pretreatment can reduce oxidative stress injury and apoptosis and improve MIRI， and its mechanism of action may be related to the regulation of SIRT1/PGC-1α signaling pathway.

译

关键词

心肌缺血再灌注损伤; 心肌梗死; 益心方; 作用机制; 大鼠模型; 中药研究

Keywords

myocardial ischemia-reperfusion injury; myocardial infarction; Yixin Formula; mechanism of action; rat model; traditional Chinese herbal medicine research

译

近年来，尽管在疾病诊断、治疗以及更好地控制危险因素方面取得了显著进展，但缺血性心脏病因其高发病率和高病死率，仍是主要的死亡原因之一，严重威胁人类健康^［

1］。急性心肌梗死患者借助溶栓术、经皮冠状动脉介入术可以挽回生命，但一些患者术后却发生了心功能不全、血压骤降、心律不齐甚至猝死，在恢复血液灌注后，缺血区心肌的损伤反而比缺血期更加严重，这种现象称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI），也是导致缺血性心脏病患者伤残甚至死亡的重要原因^{［参考文献 2-5

2-5］}。相关文献^{［参考文献 6

百度学术

6］}报道，氧化应激是MIRI重要的发病机制，可能会诱导心肌细胞凋亡。沉默信息调节因子1（SIRT1）和过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子-1α（PGC-1α）是氧化应激通路上的重要蛋白。研究^{［参考文献 7

百度学术

7］}表明，SIRT1在心脏、大脑和其他实质器官的缺血再灌注损伤中起着重要的保护作用；PGC-1α在抗氧化应激中发挥着关键作用，其表达可诱导细胞抗氧化酶表达升高，提高抗氧化能力。

中医药在治疗心血管疾病的同时能够减少并发症的发生，恢复机体的正常生理功能，增强抗病御邪能力，进而达到降低致残率、病死率的目的^［

8-9］。益心方是本课题组临床经验用方，有温通阳气、活血祛瘀之功效。本研究通过建立MIRI大鼠模型，观察益心方预处理对MIRI的保护作用，同时探讨其作用机制是否为通过SIRT1/PGC-1α信号通路改善MIRI，减轻氧化应激损伤和细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

清洁级雄性Wistar大鼠60只，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司。动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0011。动物使用许可证号：SCXK（沪）2020-0002。实验动物常规饲养于上海中医药大学实验动物中心，室温22～25 ℃，自然光照，自由饮水进食，适应性喂养7 d。实验操作流程严格遵循上海中医药大学实验动物伦理委员会的相关法规。本实验方案经过上海中医药大学实验动物福利与伦理委员会审查（伦理批准号：PZSHUTCM220711019）。

1.1.2 药物与试剂

实验用益心方中药配方颗粒组成：黄芪15 g（批号：21067604），川芎12 g（批号：21087144），丹参12 g（批号：21046664），红景天10 g（批号：19126704），当归9 g（批号：21077504），香附9 g（批号：21066854），桂枝6 g（批号：21056424）。以上中药颗粒剂由江阴天江药业有限公司提供，使用前用蒸馏水充分溶解、混匀，分装编号后冷藏备用。

SIRT1抑制剂sirtinol，上海源叶生物科技有限公司（批号：S80707）；肝素钠注射液，赛诺菲制药有限公司生产（批号：8S13N）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒，碧云天生物科技有限公司（批号：P0012）；肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H₂O₂）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒，南京建成生物工程研究所（批号分别为A032-1-1、BC0955、BC0025、BC3595、BC0170）；原位末端转移酶标记技术（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒，碧云天生物技术有限公司（批号：C1091）；二甲基亚砜（DMSO），德国Merck公司（批号：D2650）；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC），北京兰杰柯科技有限公司（批号：BS095）； SIRT1、PGC-lα、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）蛋白、B淋巴细胞瘤-2相关X（Bax）蛋白抗体，美国Affinity公司（批号分别为DF6033、BF0402、AF6139、AF0120）；HRP标记山羊抗兔，美国Jackson公司（批号：111-035-003）。

1.1.3 主要仪器

离心机，美国Beckman公司（型号：Avanti J-15R）；电泳及转膜电源仪，美国Bio-Rad公司（型号：170-3930）；凝胶成像系统，上海勤翔科技有限公司（型号：ChemiScope 6000）；酶标仪，美国Bio Tek公司（型号：Synergy H1）；高通量研磨仪，上海净信科技有限公司（型号：JXFSTPRP-24L）；小动物呼吸机，深圳市瑞沃德生命科技有限公司（型号：R415）；动物心电图机，深圳邦健生物医疗设备股份有限公司（型号：ECG-101G）；彩色多普勒超声成像仪，上海玉研科学仪器有限公司（型号：X5 VET）。

1.2 分组与造模

将60只大鼠随机分为假手术组、心肌缺血再灌注组（模型组）、益心方预处理+心肌缺血再灌注组（益心方组）、益心方预处理+心肌缺血再灌注+SIRT1抑制剂组（益心方+抑制剂组），每组15只。术前12 h禁食，异氟烷麻醉大鼠后仰卧位固定在手术台上，气管插管，连接呼吸机辅助通气；于胸骨左侧三、四肋间开胸，暴露心脏；结扎冠状动脉左前降支，观察心电图的变化。以心电图ST段抬高≥0.1 mV，T波高耸，结扎线以下部位出现心肌组织变白视为造模成功。结扎30 min后松开结扎线，恢复血供，ST段回落1/2以上，发白组织逐渐变红即为再灌注成功^［

10］。

1.3 干预

中药组给予益心方灌胃，剂量为6.84 g/kg（生药量/体质量，按照人和动物体表面积折算的临床等效剂量比值换算^［

11］，大鼠用药剂量是人的6.3倍），每日1次。使用前益心方以1.368 g/mL的浓度配比溶于蒸馏水，益心方组和益心方+抑制剂组按10 mL/kg的剂量连续灌胃7 d，其余各组灌胃等体积的质量分数为0.9%的氯化钠溶液。术前3 d及术前20 min益心方+抑制剂组按2 mg/kg剂量尾静脉注射SIRT1抑制剂sirtinol，其余各组尾静脉注射等体积质量分数为0.9%的氯化钠溶液。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 心电图

造模前大鼠予异氟烷麻醉，仰卧位固定，连接呼吸机；消毒四肢及电极片，将电极片置于大鼠四肢末端，脱毛，开胸造模。分别记录大鼠缺血前、缺血时和再灌注后标准Ⅱ导联心电图。

1.4.2 心功能

再灌注24 h后，将大鼠麻醉仰卧位固定于手术台，连接彩色心脏多普勒超声仪，测量各组大鼠的左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短百分率（LVFS）。至少检测3个连续、完整的心动周期，计算均值。

1.4.3 心肌病理形态学及心肌梗死面积

再灌注24 h后，各组随机取3只大鼠心脏标本，4%多聚甲醛溶液固定大鼠心脏，包埋后切成3 µm厚的石蜡切片，苏木精-伊红（HE）染色法检测大鼠心肌组织结构。HE染色步骤按试剂盒说明书进行操作，在光学显微镜下观察心肌组织病理形态的改变。

各组随机取5只大鼠心脏标本，沿心脏长轴自心尖向心底将组织切取5～6片约2 mm厚的切片，将切片置于1% TTC溶液内，锡箔纸密封后放置于37 ℃恒温箱内避光染色20 min。染色完成后用4%多聚甲醛溶液固定1 h后拍照，并用ImageJ软件计算心肌组织的梗死面积。梗死面积百分比（%）=梗死面积/切片面积×100%。

1.4.4 血流动力学

再灌注24 h后，腹腔注射肝素钠注射液（0.01 mL/kg），20 min后腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，暴露颈动脉插管，当微型压力（millar）导管进入心室时，应用多导电生理仪测量左心室舒张末压（LVDP）、左心室收缩压（LVSP）、左心室内压最大上升和下降速率（+dp/dtmax、-dp/dtmax）。

1.4.5 心肌细胞凋亡指数

每组随机取5只大鼠，再灌注24 h后取心脏标本。打开胸腔，剥离大鼠心脏，切取心脏结扎部位2～3 mm厚的心脏组织，放入4%的多聚甲醛溶液中常温固定备用。石蜡包埋、切片、脱蜡、水化后，按照TUNEL试剂盒说明书步骤进行操作，在荧光显微镜下观察、拍照。

1.4.6 血清CK、LDH水平

再灌注24 h后，大鼠腹主动脉取血，静置2 h后，3 000 r/min离心15 min，取上清。按生化法相关试剂盒说明书步骤检测CK、LDH水平。

1.4.7 血清SOD、MDA、H₂O₂活性

再灌注24 h后，大鼠腹主动脉取血，静置2 h后，3 000 r/min离心15 min，取上清。按ELISA法检测相关试剂盒说明书步骤检测SOD、MDA、H₂O₂活性。

1.4.8 免疫组织化学法检测心肌组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax蛋白阳性表达

采用免疫组织化学法检测大鼠心肌组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax蛋白阳性表达。再灌注24 h后取心肌组织石蜡切片脱水，抗原修复后3%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭30 min，加入SIRT1（1∶50）、PGC-1α（1∶50）、Bcl-2（1∶50）、Bax（1∶50），一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，二氨基联苯胺（DAB）显色，中性树脂封片，光镜下观察，以棕黄色颗粒为阳性表达。使用ImageJ软件统计阳性表达的积分光密度（IOD）和阳性染色面积（Area），计算平均光密度（MOD）。MOD=IOD/Area。

1.4.9 Western blot法检测心肌组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax蛋白表达水平

采用Western blot法检测大鼠心肌组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。取100 mg左心室组织，加入组织细胞裂解液（RIPA），匀浆后离心收集上清提取组织蛋白。BCA法测定组织蛋白浓度。各孔取10 µL的蛋白上样，于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离（浓缩胶电压70 V，30 min；分离胶120 V，1 h）。将分离后的蛋白电转移（300 mA，90 min）至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。加入5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭1 h。用Tris盐缓冲液（TBS）加入吐温-20（TBST）洗膜3次，每次10 min，分别加入SIRT1（1∶500）、PGC-1α（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）。然后加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000），室温反应1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min。按增强型化学发光（ECL）试剂盒说明显影。采用ImageJ软件对蛋白条带灰度值进行分析。

1.5 统计学方法

实验数据采用SPSS22.0软件进行统计学处理。计量资料数据以 $\bar{x}$ ±s表示，符合正态分布者采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验；不符合正态分布者采用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠心电图的影响

与缺血前比较，模型组、益心方组和益心方+抑制剂组大鼠缺血30 min后Ⅱ导联ST段均有不同程度抬高（≥0.1 mV），表明大鼠心肌缺血模型建立成功。各组大鼠再灌注后ST段均有不同程度降低，表明再灌注模型建立成功。见图1。

图1 各组大鼠心电图结果

注：黑色箭头为心电图ST段。

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2.2 对大鼠心功能的影响

与假手术组比较，模型组LVEF、LVFS降低（P<0.05）。与模型组比较，益心方组LVEF、LVFS明显增高（P<0.05）。与益心方组比较，益心方+抑制剂组LVEF、LVFS明显降低（P<0.05）。见图2。

图2 各组大鼠LVFS、LVEF比较

注： A为各组大鼠心脏彩超图，B为各组大鼠LVEF、LVFS统计图。LVEF为左心室射血分数，LVFS为左心室短轴缩短率。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与益心方组比较，△P<0.05。n=5， $\bar{x}$ ±s。

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2.3 对大鼠心肌病理形态学及梗死面积的影响

光镜下假手术组心肌组织形态正常，未见水肿、纤维化及炎性浸润；模型组心肌组织整体结构异常，心肌纤维排列紊乱及坏死明显，心肌纤维可见脂肪变性，有明显的炎症细胞浸润；益心方组心肌组织形态基本正常，心肌纤维未见明显肿胀，部分心肌纤维排列紊乱，少量炎症细胞浸润；益心方+抑制剂组心肌组织整体结构异常，心肌纤维排列紊乱，心肌纤维明显坏死，坏死区有较多胶原纤维异常增生，有明显的炎症细胞浸润。见图3。

图3 各组大鼠心肌组织病理变化（HE染色，×200）

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与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死范围增加（P<0.05）。与模型组比较，益心方组大鼠心肌梗死范围缩小（P<0.05）。与益心方组比较，益心方+抑制剂组大鼠心肌梗死范围增大（P<0.05）。见图4。

图4 各组大鼠心肌梗死面积比较

注： A为各组大鼠2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色结果图，B为心肌组织梗死面积统计图。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与益心方组比较，△P<0.05。n=5， $\bar{x}$ ±s。

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2.4 对大鼠血流动力学的影响

与假手术组比较，模型组LVSP、+dp/dtmax降低，LVDP、-dp/dtmax升高（P<0.05）。与模型组比较，益心方组LVSP、+dp/dtmax升高，LVDP、-dp/dtmax降低（P<0.05）。与益心方组比较，益心方+抑制剂组LVSP、+dp/dtmax降低，LVDP、-dp/dtmax升高（P<0.05）。见图5、表1。

图5 各组大鼠血流动力学检查结果

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表1 各组大鼠血流动力学指标比较（n=5，

$\bar{x}$ ±s）

组别	LVSP/mmHg	LVDP/mmHg	+dp/dtmax/（mmHg·s^-1）	-dp/dtmax/（mmHg·s^-1）
假手术组	115.46±10.44	5.87±0.73	1 737.22±133.13	-809.94±21.70
模型组	74.94±6.32^*	13.37±1.01^*	1 098.62±116.19^*	-365.15±32.52^*
益心方组	96.57±8.30^#	9.07±0.62^#	1 570.44±104.78^#	-603.80±22.59
益心方+抑制剂组	77.76±6.80^△	11.51±0.88^△	1 275.69±136.08^△	-455.19±21.36^△

注： LVSP为左心室收缩压，LVDP为左心室舒张末压，+dp/dtmax为左心室内压最大上升速率，-dp/dtmax为左心室内压最大下降速率。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与益心方组比较，△P<0.05。

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2.5 对大鼠心肌细胞凋亡的影响

与假手术组比较，模型组凋亡指数升高（P<0.05）。与模型组比较，益心方组凋亡指数降低（P<0.05）。与益心方组比较，益心方+抑制剂组凋亡指数升高（P<0.05）。见图6。

图6 各组大鼠心肌细胞凋亡指数比较（免疫荧光染色，×400）

注： A为各组大鼠心肌细胞凋亡荧光染色图，B为心肌细胞凋亡指数统计图。TUNEL为原位末端转移酶标记技术，DAPI为4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，Merge为叠加图。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与益心方组比较，△P<0.05。n=5， $\bar{x}$ ±s。

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2.6 对CK、LDH水平的影响

与假手术组比较，模型组CK、LDH水平升高（P<0.05）。与模型组比较，益心方组CK、LDH水平降低（P<0.05）。与益心方组比较，益心方+抑制剂组CK、LDH水平升高（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清CK、LDH水平比较（n=9，

$\bar{x}$ ±s）

组别	CK/（U·mL^-1）	LDH/（U·L^-1）
假手术组	152.81±5.78	371.95±28.23
模型组	196.28±5.29^*	557.96±31.00^*
益心方组	161.60±4.39^#	427.31±25.72^#
益心方+抑制剂组	197.26±4.22^△	544.50±40.03^△

注： CK为肌酸激酶，LDH为乳酸脱氢酶。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与益心方组比较，△P<0.05。

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2.7 对SOD、MDA、H₂O₂活性的影响

与假手术组比较，模型组MDA、H₂O₂活性升高，SOD活性降低（P<0.05）。与模型组比较，益心方组MDA、H₂O₂活性降低，SOD活性升高（P<0.05）；与益心方组比较，益心方+抑制剂组MDA、H₂O₂活性升高，SOD活性降低（P<0.05）。见表3。

表3 各组大鼠SOD、MDA、H₂O₂活性比较（n=9，

$\bar{x}$ ±s）

组别	SOD/（U·mL^-1）	MDA/（nmol·L^-1）	H₂O₂/（mmol·L^-1）
假手术组	35.27±1.47	3.59±0.71	26.58±1.02
模型组	6.73±1.08^*	20.98±1.89^*	59.34±3.01^*
益心方组	33.62±2.88^#	4.47±0.18^#	27.05±2.68^#
益心方+抑制剂组	8.65±1.24^△	19.51±2.05^△	50.28±2.46^△

注： SOD为超氧化物歧化酶，MDA为丙二醛，H₂O₂为过氧化氢。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与益心方组比较，△P<0.05。

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2.8 对大鼠SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

先采用免疫组织化学法检测，结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高（P<0.05）；与模型组比较，益心方组大鼠心肌组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2蛋白表达升高，Bax蛋白表达降低（P<0.05）；与益心方组比较，益心方+抑制剂组大鼠SIRT1、PGC-1α、Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高（P<0.05）。

进一步用Western blot法检测，结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高（P<0.05）；与模型组比较，益心方组大鼠心肌组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2蛋白表达升高，Bax蛋白表达降低（P<0.05）；与益心方组比较，益心方+抑制剂组大鼠SIRT1、PGC-1α、Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高（P<0.05）。见图7。

图7 各组大鼠SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax表达比较

注： A为各组大鼠蛋白阳性表达情况（免疫组织化学染色，×400），B为各组大鼠蛋白电泳条带图，C为各组大鼠蛋白阳性表达（免疫组织化学染色）统计图，D为各组大鼠蛋白相对表达量统计图。SIRT1为沉默信息调节因子1，PGC-1α为过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子-1α，Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2蛋白，Bax为B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与益心方组比较，△P<0.05。n=3， $\bar{x}$ ±s。

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3 讨论

MIRI是急性心肌梗死血管再通术后常见的病理现象，探讨缺血再灌注损伤的防治措施及相应的作用机制，对提高心血管疾病患者的预后和生存率具有重要的研究意义^［

12］。目前，急性心肌梗死的最佳、最有效的治疗方法是快速、安全恢复缺血心肌血供。缺血心肌组织重新获得血液供应后，也会导致氧化应激损伤、细胞凋亡等现象，进而加重心肌的损伤。遗憾的是MIRI的机制尚未清晰，其机制与钙离子超载、氧化应激、铁死亡、线粒体功能障碍及炎症反应等密切相关^{［参考文献 6

百度学术

6，参考文献 13-15

13-15］}。

氧化应激损伤是促进细胞凋亡的主要途径之一。氧化应激水平失衡后，活性氧增多，线粒体有氧代谢能力受损，进而损伤心肌，造成心肌细胞凋亡。线粒体的功能稳态对于维持氧化应激平衡有重要作用，氧化应激在心脏保护中也发挥着重要作用^［

16］。因此，抑制氧化应激损伤、优化线粒体功能、增强心肌细胞抗损伤能力是缺血心肌保护的新选择。SIRT1/PGC-1α信号通路以特异的方式调节细胞的凋亡和代谢，激活SIRT1，减轻氧化应激损伤和减少细胞凋亡，SIRT1可能成为治疗缺血性心脏病的潜在靶点^{［参考文献 17-18

17-18］}。PGC-1α是重要的转录共激活因子，也是抗细胞氧化应激的有效防御剂。研究^{［参考文献 19

百度学术

19］}发现，上调SIRT1可减少氧化应激损伤，激活SIRT1使PGC-lα赖氨酸残基去乙酰化，启动PGC-lα转录活性，从而促进下游核受体等蛋白分子的表达，进一步调节细胞能量代谢和抗氧化应激能力，调节机体的生理及病理状态。Bcl-2家族是影响细胞凋亡的新基因，Bax是凋亡的启动子，Bcl-2和Bax决定了凋亡信号表达后细胞的存活或死亡^{［参考文献 20

百度学术

20］}。

中医学中没有“心肌缺血再灌注损伤”病名的记载，根据临床表现及病因病机，可将其归属于“胸痹”“真心痛”等范畴，病机以本虚标实、心脉痹阻为关键，治宜益气温阳、活血化瘀^［

21-22］。在心肌缺血时期，心肌失于滋养，生化无力，心阳虚衰；再灌注后虽然血管再通，但机体心气亏虚，统帅血液无力，血液运行仍旧受阻。益心方中黄芪、桂枝益气温阳止痛；川芎、丹参、红景天活血祛瘀通血脉，当归养血活血；香附行气止痛、为气中血药，川芎为血中气药，二者合用活血且可调畅气机^{［参考文献 23-25

23-25］}。本实验结果显示，益心方预处理可降低MDA、H₂O₂活性，升高SOD活性，可在一定程度上改善心肌缺血再灌注导致的氧化应激损伤，从而减轻模型大鼠心肌细胞凋亡及缩小心肌梗死面积。本研究结果与Tian等^{［参考文献 26

百度学术

26］}的研究结果有较好的一致性。课题组通过查阅相关文献^{［参考文献 27

百度学术

27］}，选择了认可度较高的SIRT1抑制剂sirtinol。本研究结果证实其能够逆转益心方减轻MIRI大鼠心肌细胞凋亡的作用，进一步说明益心方调控PGC-1α等蛋白表达、减轻心肌细胞凋亡与SIRT1相关。

综上，本研究发现益心方预处理可减少大鼠心肌缺血再灌注引起的氧化应激损伤，提高细胞抗氧化能力，抑制细胞凋亡，保护心肌；益心方可能通过激活SIRT1/PGC-1α信号通路发挥对MIRI的保护作用。此外，在本实验中益心方以临床等效剂量给药，暂未进行量效研究，有待今后进一步探究。

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摘要

目的,2,探讨中药复方益心方改善心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用及其机制。,方法,2,将60只清洁级Wistar大鼠随机分为4组，即假手术组、心肌缺血再灌注组（模型组）、益心方预处理+心肌缺血再灌注组（益心方组）、益心方预处理+心肌缺血再灌注+ 沉默信息调节因子1（SIRT1）抑制剂组（益心方+抑制剂组），每组15只。各组大鼠适应性喂养7 d后，益心方组和益心方+抑制剂组给予益心方（10 mL/kg）灌胃7 d，其余各组灌胃等体积的质量分数为0.9%的氯化钠溶液。术前3 d及术前20 min，益心方+抑制剂组尾静脉注射SIRT1抑制剂sirtinol（2 mg/kg），其余各组尾静脉注射等体积的质量分数为0.9%的氯化钠溶液。假手术组只穿线不结扎；其余各组结扎冠状动脉左前降支30 min，建立心肌缺血损伤模型，术中观察心电图变化情况。再灌注后检测心电图，观察再灌注模型是否建立成功；采用超声心动图和血流动力学检测评价各组大鼠的心功能；苏木精-伊红（HE）染色法观察心肌组织病理形态学的变化；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法测定心肌梗死面积；原位末端转移酶标记技术（TUNEL）法检测心肌细胞凋亡指数；生化法检测各组大鼠血清中的肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）水平；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H,2,O,2,）活性；免疫组织化学法和Western blot法检测SIRT1、过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子-1α（PGC-lα）、B淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（Bax）表达情况。,结果,2,①与假手术组比较，模型组大鼠心电图ST段明显抬高，表明大鼠心肌缺血模型建立成功；超声心动图和血流动力学检测显示，模型组大鼠左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室收缩压（LVSP）、左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax）降低，左心室舒张末压（LVDP）、左心室内压最大下降速率（-dp/dtmax）升高（,P,<,0.05）；TTC染色结果显示，模型组大鼠心肌梗死面积增加（,P,<,0.05）；生化检测结果显示，模型组大鼠血清中CK、LDH、MDA、H,2,O,2,水平升高，SOD水平降低（,P,<,0.05）；免疫组织化学法和Western blot检测结果显示，模型组大鼠心肌组织中Bcl-2、SIRT1、PGC-1α表达下降，Bax表达升高（,P,<,0.05）。②与模型组比较，益心方组心肌梗死的面积减少，LVEF、LVFS、LVSP、+dp/dtmax升高，LVDP、-dp/dtmax降低，左心室射血量增加，心功能改善（,P,<,0.05）；血清CK、LDH、MDA、H,2,O,2,水平降低， SOD水平升高（,P,<,0.05）；心肌组织中Bcl-2、SIRT1、PGC-1α表达升高，Bax表达降低（,P,<,0.05）。③与益心方组比较，益心方+抑制剂组大鼠血清CK、LDH、MDA、H,2,O,2,水平升高，SOD水平降低（,P,<,0.05）；心肌组织中Bcl-2、SIRT1、PGC-1α表达降低、Bax表达升高（,P,<,0.05）。,结论,2,益心方预处理能够减轻氧化应激损伤和细胞凋亡，改善心肌缺血再灌注损伤，其作用机制可能与调控SIRT1/PGC-1α信号通路相关。

Abstract

Objective,2,To observe the effect of Traditional Chinese medicine compound Yixin Formula（YXF） to improve myocardial ischemia-reperfusion injury（MIRI）in rats and its mechanism.,Methods,2,Sixty clean-grade Wistar rats were randomly divided into four groups： sham-operated group， myocardial ischemia-reperfusion group （model group）， Yixin Formula+myocardial ischemia-reperfusion group （YXF group）， Yixin Formula+myocardial ischemia-reperfusion+SIRT1 inhibitor group （YXF+inhibitor group）， 15 rats in each group. After adaptive feeding of rats in each group for 7 d， YXF and YXF + inhibitor groups were given YXF 10 mL/kg by gavage for 7 d， and the remaining groups were given an equal volume of 0.9% sodium chloride solution by gavage. Three days and 20 min before surgery， an inhibitor of SIRT1， sirtinol（2 mg/kg）， was injected into the tail vein of rats in the YXF + inhibitor group， and an equal volume of 0.9% sodium chloride solution was injected into the tail vein of rats in the other groups. The sham-operated group was only threaded without ligation， while the left anterior descending branch of the coronary artery was ligated for 30 min in the remaining groups to establish a model of myocardial ischemic injury， and the changes of ECG were observed during operation. After reperfusion， ECG was examined to observe whether the reperfusion model was successfully established， and echocardiography and hemodynamics were used to examine the cardiac function of rats in each group. HE staining was used to observe the histomorphological changes of myocardial tissue. TTC staining was used to determine the area of myocardial infarction. TUNEL method was used to detect the apoptosis rate of myocardial cells. The biochemical method was used to detect the levels of CK and LDH in the serum of rats in each group. ELISA was used to detect the levels of SOD， MDA and H,2,O,2 ,in the serum of rats in each group. The protein expression of SIRT1， PGC-lα， Bcl-2 and Bax was detected by immunohistochemistry and Western blot.,Results,2,① Compared with the sham-operated group， the ST segment of the ECG was significantly elevated in the model group， indicating that the rat myocardial ischemia model was successfully established. Echocardiography and hemodynamic tests showed that LVEF， LVFS， LVSP， +dp/dtmax were decreased and LVDP， -dp/dtmax were increased in the model group （,P,<,0.05）. TTC staining showed that the myocardial infarct area was increased in the model group （,P,<,0.05）. The biochemical results showed that the serum levels of CK， LDH， MDA， and H,2,O,2, were increased， and the level of SOD was decreased in the model rats （,P,<,0.05）. The immunohistochemical and Western blot results showed that the expressions of Bcl-2， SIRT1 and PGC-1α proteins were decreased， and Bax expression was increased in the myocardial tissue of the model rats （,P,<,0.05）. ② Compared with the model group， the YXF could reduce the area of myocardial infarction. The levels of LVEF， LVFS， LVSP， +dp/dtmax were increased， the levels of LVDP， -dp/dtmax were decreased， the left ventricular ejection volume was increased， and the cardiac function was improved in the YXF group （,P,<,0.05）. The levels of CK， LDH， MDA， H,2,O,2, were decreased and the level of SOD was increased in the YXF group. The expressions of Bcl-2， SIRT1 and PGC-1α in myocardial tissues of the rats were increased， and the expression of Bax was decreased in the YXF group （,P,<,0.05）. ③ Compared with the YXF group， the CK， LDH， MDA， and H,2,O,2, levels increased and SOD level decreased in the YXF + inhibitor group （,P,<,0.05）. The expressions of Bcl-2， SIRT1， and PGC-1α were decreased and the expression of Bax was increased in the myocardial tissues of the YXF+inhibitor group （,P,<,0.05）.,Conclusion,2,YXF pretreatment can reduce oxidative stress injury and apoptosis and improve MIRI， and its mechanism of action may be related to the regulation of SIRT1/PGC-1α signaling pathway.

关键词

心肌缺血再灌注损伤心肌梗死益心方作用机制大鼠模型中药研究

Keywords

myocardial ischemia-reperfusion injurymyocardial infarctionYixin Formulamechanism of actionrat modeltraditional Chinese herbal medicine research

references

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