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基于羧甲基壳聚糖的槲皮素纳米载药体系的制备和性能研究
实验研究 | 更新时间:2023-03-21
    • 基于羧甲基壳聚糖的槲皮素纳米载药体系的制备和性能研究

    • Study on preparation and performance of quercetin nano⁃drug delivery system based on carboxymethyl chitosan

    • 汲丽丽

      ,  

      张釜源

      ,  

      郑韩

      ,  

      李双燕

      ,  

      杨晶

      ,  

      于澎

      ,  
    • 上海中医药杂志   2023年57卷第3期 页码:72-79
    • DOI:10.16305/j.1007-1334.2023.2209077    

      中图分类号:

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  • 汲丽丽,张釜源,郑韩,等.基于羧甲基壳聚糖的槲皮素纳米载药体系的制备和性能研究[J].上海中医药杂志,2023,57(3):72-79. DOI: 10.16305/j.1007-1334.2023.2209077.

    JI Lili,ZHANG Fuyuan,ZHENG Han,et al.Study on preparation and performance of quercetin nano⁃drug delivery system based on carboxymethyl chitosan[J].Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine,2023,57(3):72-79. DOI: 10.16305/j.1007-1334.2023.2209077.

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    摘要

    目的

    制备含锰二氧化硅载体,用其负载槲皮素并用羧甲基壳聚糖进行封堵,研究该纳米载药体系的结构和释药特征,拟合含锰二氧化硅纳米球(MMS)吸附槲皮素的热力学和动力学模型。

    方法

    以表面活性剂为模板合成含锰二氧化硅载体,采用兰缪尔(Langmuir)、弗伦德利希(Freundlich)和乔姆金(Temkin)等温吸附模型对含锰二氧化硅纳米载体吸附槲皮素热力学数据进行模型拟合,采用准一级动力学、准二级动力学和颗粒内扩散模型对吸附动力学数据进行模型拟合。采用透析袋法评价纳米载药体系体外释放情况。

    结果

    基于羧甲基壳聚糖的槲皮素纳米载药体系被成功制备,含锰二氧化硅载体对槲皮素的热力学和动力学吸附按照25 ℃>35 ℃>45 ℃的顺序减小,热力学拟合最佳模型是Freundlich等温吸附模型,动力学拟合最佳模型是准二级动力学模型。在pH6.5时,纳米载药体系在50 h内累计释放达92.53%,高于其他pH值(5.5,7.4)下的累计释放量,这种影响有利于治疗肿瘤。

    结论

    含锰二氧化硅载体吸附槲皮素符合Freundlich等温吸附模型和准二级动力学模型。温度对载体吸附槲皮素有影响,且环境pH值影响纳米载药体系中槲皮素的释放。

    Abstract

    Objective

    The manganese-containing silica carrier was prepared, which was loaded with quercetin and blocked with carboxymethyl chitosan. The structure and release characteristics of the nano-drug loading system were studied, and the thermodynamic and kinetic model of quercetin adsorption by manganese-containing silica nanoparticles was fitted.

    Methods

    Manganese-containing silica carriers were synthesized using surfactant as template. Langmuir, Freundlich and Temkin isothermal adsorption models were used to fit the thermodynamic data of quercetin adsorption on manganese-containing silica nanoparticles. Quasi-first-order kinetics, quasi-second-order kinetics and intra-particle diffusion model were used to fit the adsorption kinetic data. The in vitro release of nano-drug loading system was evaluated by dialysis bag method.

    Results

    The nano-drug loading system of quercetin based on carboxymethyl chitosan was successfully prepared. The thermodynamic and kinetic adsorption of quercetin on manganese-containing silica carriers decreased in the order of 25 ℃>35 ℃>45 ℃. The best thermodynamic fitting model was Freundlich isothermal adsorption model, and the best kinetic fitting model was quasi-second-order kinetic model. In pH6.5, the cumulative release of nano-drug loading system reached 92.53% within 50 hours, which was higher than that at other pH values (5.5 and 7.4). This effect was beneficial to the treatment of tumors.

    Conclusion

    The adsorption of quercetin on manganese-containing silica carrier corresponds with Freundlich isothermal model and quasi-second-order kinetic model. The temperature has an effect on the adsorption of quercetin on the carrier, and the environmental pH value affects the release of quercetin in the nano-drug loading system.

    槲皮素广泛存在于银杏、山楂、西红花等诸多中药中

    1-3。它是一种具有多种生物活性的多羟基黄酮类化合物,具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、神经保护等药理作用4-7。由于槲皮素的溶解度较低(0.7~7.7 mg/L),从而影响其吸收8-10,因此研究者经常将槲皮素载入纳米载体材料中,以便更好地发挥疗效。介孔二氧化硅纳米粒子由于具有大的比表面积、可调节的多孔结构和可修饰的内外表面等优点11-12,在生物医学领域受到了广泛关注。将药物封装在介孔二氧化硅纳米载体中,然后在载体表面进行修饰或功能化,此种设计可负载、保护及输运药物到靶向位点,并在特定的内部或外部刺激下释放药物。这可以保护药物在经过多重屏障时不受影响,同时靶向人体特定细胞,减少对正常细胞的损伤,并能保证靶细胞内药物的可控释放。

    为了确保槲皮素具有理想的控释性能以及在生理条件下的可降解性,本研究将槲皮素载入氨基化含锰二氧化硅纳米载体中,为防止输送过程中槲皮素脱落,用羧甲基壳聚糖(CMCS)封堵载体材料表面,并对制备的载药体系进行相应的表征,研究该体系在不同pH值环境下的药物释放情况;在此基础上,研究氨基化介孔含锰二氧化硅纳米载体对槲皮素的吸附热力学和动力学特征,并用模型对吸附曲线进行拟合,考察载体的载药特性,同时研究该载药体系的体外释放情况。通过可控的方式对槲皮素进行负载、输送并在靶向位点进行持续释放,可克服传统化疗药物的主要限制,同时最大程度地提高基于介孔二氧化硅纳米载体的生物医学适用性,为纳米载体药物的实际应用提供一定的理论基础和实践经验。

    1 材料

    1.1 仪器

    pH计,上海精密科学仪器有限公司(型号:PHS25);磁力搅拌器,上海梅香仪器有限公司(型号:HJ-3);SK-1快速混匀机,江苏金坛江南仪器厂(型号:YGX-5KG);移液枪,中国大龙兴创实验仪器(北京)有限公司(型号:YE4A263820);高速冷冻离心机,德国Sigma公司(型号:D-37520);恒温振荡器,上海福玛实验设备有限公司(型号:QYC-2102C);真空干燥箱,上海精宏实验设备有限公司(型号:DZF-6050);循环水真空泵,巩义市予华仪器有限责任公司(型号:SHZ-DⅢ);电子天平,上海佑科仪器仪表有限公司(型号:FA1004B);EAT-2托盘天平,常熟市意欧仪器仪表有限公司(型号:K104-0162);紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司(型号:1650E);离心机,湖南凯达科学仪器有限公司(型号:K104-0162);超声波清洗器,昆山超声仪器有限公司(型号:KQ-250);摇床,美国赛洛捷克(Scilogex)公司(型号:SLK-O3000-S)。

    X射线衍射(XRD)表征:日本理光(Ricoh)株式会社Rigaku–D/MAX–PC 2500 X射线衍射仪(型号:Arlequinox100),Cu Ka(λ=1.540 5 Å)射线源,电压40 kV,电流200 mA。

    热重分析(TGA):美国Perkin Elmer热分析系统(型号:TGA103)。

    扫描电镜(SEM):荷兰Philips–FEI公司,XL30场发射环境扫描电子显微镜(型号:Nova NanoSEM 450)。

    X射线光电子能谱(XPS)表征:英国V.G. Scientific公司(型号:EscaLab 250Xi),ESCALAB MKⅡ X射线光电子能谱仪,MgKα为射线源。

    透射电子显微镜(TEM):德国Thermo Fisher Scientific公司(型号:JEM-2100F)。

    Zeta电位和动态光散射(DLS)测定:英国Malvern公司(型号:1190),nano ZS Zeta粒度仪。

    1.2 试剂和药物

    乙醇(批号:130106-201904)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,批号:20210240101),国药集团化学制剂有限公司;三乙醇胺(TEA,批号:190062-201902)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES,批号:201711111433R)、1-(3,二甲氨基丙基)-3基碳二亚胺盐酸盐(EDC,批号:20190410)、硫酸锰(MnSO4,批号:20180517)、CMCS(批号:20192140106),上海麦克林生化科技有限公司;原硅酸四乙酯(TEOS,批号:2022041705A)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,批号:20211009)、槲皮素(批号:100081-201610),上海源叶生物制剂有限公司。

    2 方法

    2.1 含锰二氧化硅的制备

    将2.182 g的CTAB和1.1 mL的TEA分散于2 mL乙醇和20 mL蒸馏水组成的混合溶液中。在25 ℃下,搅拌,得到透明溶液,将10 mL的MnSO4溶液(8 mg/mL)逐滴添加至上述溶液中。随后,将此混合溶液回流加热至80 ℃,缓慢滴加TEOS (1.5 mL)和APTES(0.15 mL)的混合物,反应4 h后,自然冷却、离心,收集得到棕色产物,并依次用水和乙醇进行洗涤,以除去残留的反应物,得到样品在40 ℃的真空下干燥24 h,再放入马弗炉中(550 ℃)持续煅烧6 h去除CTAB,得到含锰二氧化硅纳米球(MMS)

    13

    2.2 氨基化含锰二氧化硅的合成

    将0.2 g的MMS分散于20 mL无水乙醇中,超声30 min(500 W)后放入水浴锅进行加热回流,温度升至80 ℃时加入0.18 mL的APTES,并在该温度下回流24 h,通过离心(9 500 r/min,10 min)得到产物氨基化含锰二氧化硅,并用水和乙醇各洗涤3次,于37 ℃下真空干燥得到干燥的氨基化含锰二氧化硅纳米球(MMS-NH2)。

    2.3 氨基化含锰二氧化硅负载槲皮素的制备

    称取槲皮素0.060 8 g溶于20 mL乙醇中,加入氨基化含锰二氧化硅载体50 mg,超声分散20 min后放在磁力搅拌器中避光混匀,室温20 ℃下避光搅拌24 h,离心(9 500 r/min,10 min)后,去除上清液并避光保存,用于测量吸光度(紫外可见吸收光谱在373 nm处测定吸光度),计算槲皮素包封率以及载药量。得到的样品采用水和乙醇各洗涤3次,37 ℃下真空干燥12 h得到负载槲皮素的二氧化硅(MMS-QUE)。

    2.4 活化羧甲基壳聚糖的羧基

    称取羧甲基壳聚糖10 mg分散于10 mL超纯水中,向其加入EDC25 mg和NHS15 mg,持续搅拌6 h进行羧基的活化。

    2.5 CMCS封堵负载槲皮素的含锰二氧化硅

    将上述装载槲皮素的氨基化介孔二氧化硅、羧基化的CMCS混合,室温下持续振荡24 h。得到的混合体系离心(9 500 r/min,10 min),保留上清液,将沉淀洗涤,37 ℃干燥保存,得到装载槲皮素且经CMCS封堵的载药体系(MMS-QUE-CMCS)。整个制备过程如图1所示。

    fig

    图1  MMS⁃QUE⁃CMCS的制备流程和响应性药物释放过程

    注:  TEOS为原硅酸四乙酯;APTES为3-氨丙基三乙氧基硅烷;CTAB为十六烷基三甲基溴化铵;MnSO4为硫酸锰;MMS为含锰二氧化硅纳米球;NH2为氨基;MMS-QUE-CMCS为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系;QUE为槲皮素;CMCS为羧甲基壳聚糖;SiO2为二氧化硅。

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    2.6 载体吸附热力学测试

    称取8 mg MMS-NH2放入10 mL样品瓶中,样品瓶用锡纸完全包裹。用100 mL容量瓶配制300 mg/L槲皮素溶液,并用浓度梯度法依次配制浓度为20、40、60、80、100、150、200、250、300 mg/L的槲皮素溶液,各取8 mL分别加入10 mL样品瓶,并在25、35、45 ℃下振荡2 h。将振荡后的溶液倒入15 mL离心管离心(4 000 r/min,10 min),取上清液在波长373 nm下测量吸光度,计算溶液中槲皮素的含量,分别计算3个温度下的平衡吸附量。

    2.7 载体吸附动力学测试

    称取8 mg氨基化介孔二氧化硅纳米载体放入15 mL离心管中,离心管用锡纸完全包裹。用25 mL容量瓶配置200 mg/L槲皮素溶液,取8 mL加入15 mL离心管中并在25 ℃下振荡,将振荡后的溶液分别在1、10、20、30、40、50、60 min时离心(4 000 r/min,10 min),上清液在波长373 nm下测量吸光度,计算溶液中槲皮素的含量,得到25 ℃下的平衡吸附量。

    2.8 吸附热力学模型

    采用兰缪尔(Langmuir)、弗伦德利希(Freundlich)和乔姆金(Temkin)等温吸附模型对吸附热力学数据进行模型拟合

    14。各模型方程如下:

    Langmuir等温吸附模型:CeQe=1bQm+1QmCe

    Freundlich等温吸附模型:lnQe=1nlnCe+lnkf

    Temkin等温吸附模型:Qe=RTmlnCe+RTmlna

    式中:Ce为浓度,mg/L;Qe为吸附量,mg/g;Qm为饱和吸附量,mg/g;b为Langmuir常数,L/mg;n为Freundlich方程的异质性因子;kf为Freundlich吸附系数,mg/g;R为理想气体常数,8.314 J/(K·mol);T为温度,K;m为Temkin吸附平衡常数;a为Temkin吸附平衡常数。

    2.9 吸附动力学模型

    采用准一级动力学、准二级动力学和颗粒内扩散模型对吸附动力学数据进行模型拟合。各动力学模型方程如下:

    准一级动力学模型:ln(Qe-Qt)=lnQei-k1t

    准二级动力学模型:tQt=1k2Q2ei+tQei

    颗粒内扩散模型:Qt=C+kidt1/2

    式中:Qtt时刻时的吸附量,mg/g;Qei为吸附平衡时的理论饱和吸附量,mg/g;k1为准一级速率方程常数,min-1;k2为准二级速率方程常数,g/(mg·min);t为吸附时间,min;C为颗粒内扩散模型常数,mg/g;kid为内扩散速率常数,mg/(g·min1/2);t1/2为时间的平方根,min1/2

    2.10 MMS-QUE-CMCS的体外药物释放

    采用透析袋法评价载药体系体外释放情况。将10 mL含有8 mg载药体系的混悬液,装入预活化的透析袋中。透析袋置入40 mL的磷酸缓冲盐溶液(PBS;pH 7.4、6.5、5.5),在不同温度(25、35、45 ℃)恒温水浴中以120 r/min的速度振摇72 h。在0.5、1、1.5、2……72 h分别取出3 mL释放介质用紫外可见分光光度计测量373 nm下的吸光度,补充对应pH等体积PBS介质。每个实验都重复3次,计算槲皮素累积释放率并进行分析。

    载药量和包封率按照如下公式进行计算:

    载药=装载的药载体的总(包括载体和所装药物的)×100%
    包封=被载入的药物投入的总药量×100%

    3 结果

    3.1 样品表征

    MMS的SEM图如图2(a)所示。结果表明,掺锰介孔二氧化硅为球形,粒径分布均匀并具有良好的分散性。通过DLS试验进一步证实了MMS的均匀性,如图2(b)所示,MMS的粒径较窄(在100~150 nm之间),这种窄峰形也表明MMS的粒径相对均匀。

    fig

    图2  含锰二氧化硅纳米球(MMS)的扫描电镜及粒径分布情况

    注:  (a)为扫描电镜图;(b)为粒径分布曲线。

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    为了证明锰的成功掺杂,用XPS对MMS样品进行表征,分析了锰的状态。如图3(a)所示,Mn2p轨道在641.4、645.5、653.1 eV处分别出现了3个特征峰。在641.4、645.5 eV处的两个峰属于Mn2p3/2轨道

    15,653.1 eV处为Mn2p1/2轨道,其与641.5 eV相差11.6 eV,与Mn3O4的自旋轨道分裂能量相近16。MMS-QUE-CMCS的XPS谱图的Mn峰值与MMS一样。另外,分析MMS和MMS-QUE-CMCS中O、N和Si的高分辨能谱图,如图3(b)所示,O1s、N1s和Si2p的结合能分别为531.7、399.7、102.8 eV。同时在MMS-QUE-CMCS的XPS谱图中发现一个新峰,峰值为283.7 eV,该值对应于C1s的电子结合能,这说明药物被成功负载在含锰二氧化硅载体上。

    fig

    图3  样品的谱图

    注:  (a)为MMS的X射线光电子能谱(XPS)图;(b)为MMS和MMS-QUE-CMCS中O、N和Si高分辨能谱图;MMS为含锰二氧化硅纳米球;MMS-QUE-CMCS为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系;Mn为锰。

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    图4对MMS进行的SEM图和相应元素面分布图可以看出,MMS中含有硅、氧和锰元素,且锰元素分布与硅、氧的分布一致,表明锰已成功掺杂到二氧化硅中。相应的能谱仪(EDS)光谱也证实了MMS中含有硅、氧和锰元素,锰掺杂量为17.3%(质量比)

    17,为硅框架中锰成分的存在提供了有力的依据。

    fig

    图4  含锰二氧化硅纳米球(MMS)的表征

    注:  a为扫描电镜图;b、c、d为元素面分布图;e为能谱仪(EDS)光谱图。

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    MMS负载槲皮素前后的TEM图如图5所示,可见MMS为均匀球形,粒径在140~175 nm之间。当MMS装载槲皮素后,MMS内的孔因被槲皮素填充而变得模糊不清,MMS-QUE-CMCS的粒径在180~280 nm之间,比MMS的粒径要大。与掺杂前的MMS相比,MMS-QUE-CMCS因负载槲皮素和被CMCS包覆而具有明显的核壳结构。

    fig

    图5  样品的透射电镜(TEM)图

    注:  a为含锰二氧化硅纳米球(MMS);b为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系(MMS-QUE-CMCS)。

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    图6给出了MMS、MMS-QUE和MMS-QUE-CMCS的XRD图。主峰22.5°可标记为非晶态二氧化硅

    18。33°处的衍射峰属于褐锰矿-1Q(Mn2+Mn3+6SiO12, JCPDS no. 33-0904)相19,表明锰成功地加入到二氧化硅中。另外,将MMS装载槲皮素并涂上CMCS后,峰的位置没有明显变化,表明掺锰二氧化硅的结构是稳定的。

    fig

    图6  样品的X射线衍射图(XRD)

    注:  a为含锰二氧化硅纳米球(MMS);b为负载槲皮素的二氧化硅(MMS-QUE);c为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系(MMS-QUE-CMCS)。

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    Zeta电势可用于评价MMS纳米颗粒之间的静电斥力,继而研究MMS在悬浮液中的稳定性

    20。如图7所示,由于在二氧化硅表面富集了大量的硅羟基负电荷,MMS的Zeta电位约为-20.05 mV。MMS经氨基化处理后得到MMS-NH2,MMS-NH2的Zeta电位为-15.02 mV,这是因为二氧化硅中的硅羟基被带正电荷的氨基中和。在负载QUE后,MMS-QUE的Zeta电位下降到-24.93 mV,与MMS相比,MMS-QUE的Zeta电位明显降低,这可能与QUE的酚羟基有关。同时,这也证明了QUE的成功装载。经CMCS包覆后,MMS-QUE-CMCS的Zeta电位降低至-38.75 mV,这是由于在中性条件下,含锰二氧化硅表面的CMCS中羧基失去质子因而带有一定的负电荷,这种负电荷使MMS-QUE-CMCS具有较低的Zeta电位。

    fig

    图7  MMS、MMS⁃NH2、MMS⁃QUE和MMS⁃QUE⁃CMCS的Zeta电位图

    注:  MMS为含锰二氧化硅纳米球;MMS-NH2为氨基化含锰二氧化硅纳米球;MMS-QUE为负载槲皮素的二氧化硅;MMS-QUE-CMCS为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系。

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    图8所示,将MMS,MMS-QUE和MMS-QUE-CMCS以10 ℃/min的速度从室温加热到800 ℃,在这个过程中,3种样品均表现出一定程度的持续失重状态。加热过程中MMS由于其表面和内部的水分子释放,其质量损失表现在室温到800 ℃之间较宽的温度范围,总失重约为13.81%,而MMS-QUE的总失重约为16.97%,MMS-QUE-CMCS的总失重约为25.93%。MMS-QUE-CMCS具有较高的总失重,这是由于在加热过程中槲皮素和CMCS的损失。

    fig

    图8  样品热重曲线图

    注:  a为含锰二氧化硅纳米球(MMS);b为负载槲皮素的二氧化硅(MMS-QUE);c为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系(MMS-QUE-CMCS)。

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    采用N2吸附法确定样品的比表面积、孔体积和孔径,MMS负载槲皮素前后的N2吸附-解吸等温线见图9。MMS和MMS-QUE-CMCS都具有H2型滞回环的Ⅳ型等温线。MMS的比表面积为922.21 m2/g,孔体积为0.257 cm³/g,说明MMS适合作为药物载体。与MMS相比,MMS-QUE-CMCS的比表面积为164.04 m2/g,孔体积为0.151 cm³/g。相比于MMS,MMS-QUE-CMCS的孔表面积和孔体积减小,表明槲皮素已成功加载到载体MMS的孔隙中。

    fig

    图9  样品的N2吸附/解吸等温线图

    注:  a为含锰二氧化硅纳米球(MMS);b为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系(MMS-QUE-CMCS)。

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    MMS和MMS-QUE-CMCS的孔径分布曲线表明,MMS具有较窄的孔径分布,为3~5 nm之间,这种狭窄的峰形表明MMS的孔径分布比较均匀。与MMS相比,MMS-QUE-CMCS的孔径分布没有明显的变化,这说明槲皮素的负载和CMCS的包封对MMS的孔径影响不是很大。见图10

    fig

    图10  样品的孔径分布曲线图

    注:  a为含锰二氧化硅纳米球(MMS);b为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系(MMS-QUE-CMCS)。

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    3.2 吸附热力学

    在20~300 mg/L的浓度范围内,随着槲皮素浓度的增加,载体吸附槲皮素的量增加,25 ℃、35 ℃和45 ℃都遵循这个规律。在相同的槲皮素浓度下,载体对槲皮素的吸附按照25 ℃>35 ℃>45 ℃的顺序减小,且均在槲皮素浓度达到280 mg/L时,平衡吸附量最大,25 ℃、35 ℃和45 ℃的平衡吸附量最大值分别是228 mg/g、220 mg/g和207 mg/g。见图11

    fig

    图11  氨基化含锰二氧化硅的等温吸附曲线图

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    3.3 热力学拟合

    采用Langmuir、Freundlich和Temkin吸附热力学模型对数据进行拟合,结果显示Freundlich等温吸附模型线性拟合程度优于Langmuir和Temkin等温吸附模型。Freundlich等温吸附模型线性拟合曲线的R2值明显高于Langmuir和Temkin等温吸附模型线性拟合曲线的R2值。Freundlich等温吸附模型理论吸附量与实际值相接近,表明MMS-NH2对槲皮素的吸附更接近于Freundlich等温吸附模型。见表1表2表3

    表1  兰缪尔(Langmuir)等温吸附模型相关参数
    温度/℃b/(L·mg-1Qm/(mg·g-1R2线性方程
    25 0.000 857 5 1 111.111 1 0.979 4 Ce/Qe=1.049 6+0.000 9Ce
    35 0.002 211 476.190 5 0.689 4 Ce/Qe=0.950 0+0.002 1Ce
    45 0.005 309 192.307 7 0.649 1 Ce/Qe=0.979 4+0.005 2Ce

    注:  Qm为饱和吸附量,b为Langmuir常数,R为理想气体常数,Ce为浓度,Qe为吸附量。

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    表2  弗伦德利希(Freundlich)等温吸附模型相关参数
    温度/℃kf/(mg·g-11/nR2线性方程
    25 0.763 1 1.026 5 0.994 6 lnQe=1.026 5lnCe-0.270 4
    35 0.311 6 1.189 3 0.990 7 lnQe=1.189 3lnCe-1.166 1
    45 0.176 8 1.277 3 0.982 3 lnQe=1.277 3lnCe-1.732 8

    注:  Qe为吸附量,Ce为浓度,kf为Freundlich吸附系数,R为理想气体常数。

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    表3  乔姆金(Temkin)等温吸附模型相关参数
    温度/℃maR2线性方程
    25 28.255 4 0.038 01 0.913 7 Qe=-286.72+87.685lnCe
    35 21.252 5 0.029 05 0.815 0 Qe=-426.40+120.490lnCe
    45 32.781 8 0.033 78 0.896 3 Qe=-273.23+80.650lnCe

    注:  Qe为吸附量,Ce为浓度,m为Temkin吸附平衡常数;a为Temkin吸附平衡常数。

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    3.4 吸附动力学

    随着吸附时间的增加,对槲皮素的吸附先快速增加后逐渐平稳,最后在40 min时达到吸附平衡,25 ℃、35 ℃、45 ℃下均遵循这个变化趋势。相同时间内,对槲皮素的吸附量按照25 ℃>35 ℃>45 ℃的顺序逐渐降低。从热力学和动力学吸附数据来看都是25 ℃比较适合MMS-NH2吸附槲皮素,因此该载体适合于实际生产应用。见图12

    fig

    图12  氨基化含锰二氧化硅纳米载体对槲皮素的吸附动力学曲线图

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    3.5 动力学拟合

    采用准一级动力学模型、准二级动力学模型和颗粒内扩散模型对动力学数据进行拟合分析,结果发现对槲皮素吸附的准二级动力学模型线性拟合程度明显优于准一级动力学模型和颗粒内扩散模型。25 ℃、35 ℃和45℃的拟合结果均是如此。准二级动力学模型拟合的R2值高于准一级动力学模型和颗粒内扩散模型拟合的R2值,且准二级动力学模型的理论计算值Qei更接近于实际值。所以,对槲皮素的吸附过程更符合准二级动力学模型,属于化学吸附。见表4

    表4  吸附动力学相关参数
    温度/℃准一级动力学准二级动力学颗粒内扩散
    Qei/(mg·g-1k1R2Qei(mg/g)k2R2kid[mg/(g·min1/2)]C(mg/g)R2
    25 101.473 7 0.022 8 0.859 5 208.333 3 0.001 936 0.998 9 14.469 97.037 0.902 5
    35 114.823 9 0.018 8 0.851 7 196.078 4 0.001 486 0.997 9 15.002 81.636 0.902 2
    45 143.739 1 0.016 4 0.914 0 185.185 2 0.000 965 6 0.994 2 15.994 55.140 0.955 2

    注:  Qei为吸附平衡时的理论饱和吸附量,k1为准一级速率方程常数, k2为准二级速率方程常数,C为颗粒内扩散模型常数,kid为内扩散速率常数,R为理想气体常数。

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    3.6 药物的释放

    介孔二氧化硅纳米粒子具有较高的比表面积和孔径,所以二氧化硅很容易吸附和负载槲皮素。制备的MMS-NH2吸附槲皮素的包封率为98.94%,载药量达到37.56%。该载体在负载槲皮素方面比文献报道的(聚N-异丙基丙烯酰胺)凝胶纳米载体(载药量为3.18%)高很多,体现出MMS在载药方面有一定的优势。

    MMS-QUE-CMCS在不同pH条件下槲皮素的释放情况见图13。槲皮素开始释放的50 h内,在不同pH值条件下(5.5,6.5,7.4),MMS-QUE-CMCS的累计释放量分别为62.98%、92.53%和82.00%。介孔二氧化硅载体的主要问题之一是生物降解性低。硅氧骨架非常稳定,在生理条件下二氧化硅的降解相对困难,因此导致体内生物蓄积和潜在的生物安全风险。掺锰二氧化硅具有较高的药物释放量,一方面可提高二氧化硅纳米载体的生物降解性,另一方面锰是人体新陈代谢的重要微量元素之一

    21。由图13可见,在相同的时间内,在pH为6.5的环境中,载药体系释放槲皮素的量最多。槲皮素的累计释放是载药体系外部的CMCS和内部的二氧化硅共同作用的结果22,当pH值较低(如5.5)即氢离子浓度较高时,氢离子使载药体系外部的CMCS分子卷曲,其溶胀能力降低,这就阻止了槲皮素的释放,此时载药体系中槲皮素的释放主要是由外部的扩散控制,因此释放量较低。当pH值较高时,CMCS的溶胀能力增加,槲皮素的累计释放量增加。因此,当pH值为6.5时,释放量变大。而且,酸性环境可诱使药物中的锰溶解,进而破坏锰氧键,进一步使硅氧骨架坍塌。当pH值为7.4时,药物的释放量降低。推测原因如下:CMCS的羧基氢离子离去,得到羧酸根,羧酸根之间的静电排斥作用增加了整个MMS-QUE-CMCS 药物体系的体积22-24。MMS-QUE-CMCS的外层变厚,这增加了内部的槲皮素扩散的距离,阻碍了槲皮素的扩散5。所以,pH值居于5.5和7.4之间的6.5时,槲皮素释放量最大。以上结果表明,MMS-QUE-CMCS中槲皮素的释放量与环境pH值密切相关,具有明显的pH值依赖性,因此,可通过控制环境的pH值调节MMS-QUE-CMCS中槲皮素的释放情况。与正常组织相比,肿瘤细胞微环境通常具有弱酸性(pH值约为6.5),而掺杂的锰(Mn)-氧(O)键在肿瘤环境下更容易被破坏,从而能促进MMS载体的降解。所以,MMS-QUE-CMCS治疗肿瘤的应用前景广阔。

    fig

    图13  装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系在不同pH下的释药动力学曲线图

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    4 结论

    本研究通过原位掺杂法制备了含锰介孔二氧化硅纳米载体。由于Mn-O键能在肿瘤组织特殊的偏酸性条件下断裂,在二氧化硅骨架中产生大量的缺陷,促使二氧化硅生物降解,即Mn-O键的引入可赋予介孔二氧化硅纳米载体pH响应降解性能。将槲皮素作为模型药物封装在含锰介孔二氧化硅纳米载体,在载体表面包覆CMCS,可赋予二氧化硅载体pH响应释放性能。锰掺杂介孔二氧化硅具有较大的比表面积和较高的载药效率,对槲皮素的包封率为98.94%,载药量达到37.56%,该载体及其降解产物均具有良好的生物相容性。在考察的pH值(5.5,6.5,7.4)内,pH为6.5时平衡释放量最大,50 h达到92.53%,这有利于治疗环境偏酸性的肿瘤,这种设计可在肿瘤部位精准给药,故而可响应降解载体的含锰介孔二氧化硅纳米控释体系可为纳米材料的有效应用提供参考依据,为未来纳米材料应用领域的拓展提供理论基础。

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