pH计，上海精密科学仪器有限公司（型号：PHS25）；磁力搅拌器，上海梅香仪器有限公司（型号：HJ-3）；SK-1快速混匀机，江苏金坛江南仪器厂（型号：YGX-5KG）；移液枪，中国大龙兴创实验仪器（北京）有限公司（型号：YE4A263820）；高速冷冻离心机，德国Sigma公司（型号：D-37520）；恒温振荡器，上海福玛实验设备有限公司（型号：QYC-2102C）；真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司（型号：DZF-6050）；循环水真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司（型号：SHZ-DⅢ）；电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司（型号：FA1004B）；EAT-2托盘天平，常熟市意欧仪器仪表有限公司（型号：K104-0162）；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司（型号：1650E）；离心机，湖南凯达科学仪器有限公司（型号：K104-0162）；超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司（型号：KQ-250）；摇床，美国赛洛捷克（Scilogex）公司（型号：SLK-O3000-S）。

X射线衍射（XRD）表征：日本理光（Ricoh）株式会社Rigaku–D/MAX–PC 2500 X射线衍射仪（型号：Arlequinox100），Cu Ka（λ=1.540 5 Å）射线源，电压40 kV，电流200 mA。

热重分析（TGA）：美国Perkin Elmer热分析系统（型号：TGA103）。

扫描电镜（SEM）：荷兰Philips–FEI公司，XL30场发射环境扫描电子显微镜（型号：Nova NanoSEM 450）。

X射线光电子能谱（XPS）表征：英国V.G. Scientific公司（型号：EscaLab 250Xi），ESCALAB MKⅡ X射线光电子能谱仪，MgKα为射线源。

透射电子显微镜（TEM）：德国Thermo Fisher Scientific公司（型号：JEM-2100F）。

Zeta电位和动态光散射（DLS）测定：英国Malvern公司（型号：1190），nano ZS Zeta粒度仪。

乙醇（批号：130106-201904）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，批号：20210240101），国药集团化学制剂有限公司；三乙醇胺（TEA，批号：190062-201902）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，批号：201711111433R）、1-（3，二甲氨基丙基）-3基碳二亚胺盐酸盐（EDC，批号：20190410）、硫酸锰（MnSO₄，批号：20180517）、CMCS（批号：20192140106），上海麦克林生化科技有限公司；原硅酸四乙酯（TEOS，批号：2022041705A）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，批号：20211009）、槲皮素（批号：100081-201610），上海源叶生物制剂有限公司。

将2.182 g的CTAB和1.1 mL的TEA分散于2 mL乙醇和20 mL蒸馏水组成的混合溶液中。在25 ℃下，搅拌，得到透明溶液，将10 mL的MnSO₄溶液（8 mg/mL）逐滴添加至上述溶液中。随后，将此混合溶液回流加热至80 ℃，缓慢滴加TEOS （1.5 mL）和APTES（0.15 mL）的混合物，反应4 h后，自然冷却、离心，收集得到棕色产物，并依次用水和乙醇进行洗涤，以除去残留的反应物，得到样品在40 ℃的真空下干燥24 h，再放入马弗炉中（550 ℃）持续煅烧6 h去除CTAB，得到含锰二氧化硅纳米球（MMS）^［

将0.2 g的MMS分散于20 mL无水乙醇中，超声30 min（500 W）后放入水浴锅进行加热回流，温度升至80 ℃时加入0.18 mL的APTES，并在该温度下回流24 h，通过离心（9 500 r/min，10 min）得到产物氨基化含锰二氧化硅，并用水和乙醇各洗涤3次，于37 ℃下真空干燥得到干燥的氨基化含锰二氧化硅纳米球（MMS-NH₂）。

称取槲皮素0.060 8 g溶于20 mL乙醇中，加入氨基化含锰二氧化硅载体50 mg，超声分散20 min后放在磁力搅拌器中避光混匀，室温20 ℃下避光搅拌24 h，离心（9 500 r/min，10 min）后，去除上清液并避光保存，用于测量吸光度（紫外可见吸收光谱在373 nm处测定吸光度），计算槲皮素包封率以及载药量。得到的样品采用水和乙醇各洗涤3次，37 ℃下真空干燥12 h得到负载槲皮素的二氧化硅（MMS-QUE）。

称取羧甲基壳聚糖10 mg分散于10 mL超纯水中，向其加入EDC25 mg和NHS15 mg，持续搅拌6 h进行羧基的活化。

将上述装载槲皮素的氨基化介孔二氧化硅、羧基化的CMCS混合，室温下持续振荡24 h。得到的混合体系离心（9 500 r/min，10 min），保留上清液，将沉淀洗涤，37 ℃干燥保存，得到装载槲皮素且经CMCS封堵的载药体系（MMS-QUE-CMCS）。整个制备过程如图1所示。

图1  MMS⁃QUE⁃CMCS的制备流程和响应性药物释放过程

注：  TEOS为原硅酸四乙酯；APTES为3-氨丙基三乙氧基硅烷；CTAB为十六烷基三甲基溴化铵；MnSO₄为硫酸锰；MMS为含锰二氧化硅纳米球；NH₂为氨基；MMS-QUE-CMCS为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系；QUE为槲皮素；CMCS为羧甲基壳聚糖；SiO₂为二氧化硅。

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称取8 mg MMS-NH₂放入10 mL样品瓶中，样品瓶用锡纸完全包裹。用100 mL容量瓶配制300 mg/L槲皮素溶液，并用浓度梯度法依次配制浓度为20、40、60、80、100、150、200、250、300 mg/L的槲皮素溶液，各取8 mL分别加入10 mL样品瓶，并在25、35、45 ℃下振荡2 h。将振荡后的溶液倒入15 mL离心管离心（4 000 r/min，10 min），取上清液在波长373 nm下测量吸光度，计算溶液中槲皮素的含量，分别计算3个温度下的平衡吸附量。

称取8 mg氨基化介孔二氧化硅纳米载体放入15 mL离心管中，离心管用锡纸完全包裹。用25 mL容量瓶配置200 mg/L槲皮素溶液，取8 mL加入15 mL离心管中并在25 ℃下振荡，将振荡后的溶液分别在1、10、20、30、40、50、60 min时离心（4 000 r/min，10 min），上清液在波长373 nm下测量吸光度，计算溶液中槲皮素的含量，得到25 ℃下的平衡吸附量。

采用兰缪尔（Langmuir）、弗伦德利希（Freundlich）和乔姆金（Temkin）等温吸附模型对吸附热力学数据进行模型拟合^［

Langmuir等温吸附模型：$\frac{C_{\mathrm{e}}}{Q_{\mathrm{e}}}=\frac{\mathrm{1}}{\mathrm{b}{Q}_{\mathrm{m}}}+\frac{\mathrm{1}}{Q_{\mathrm{m}}}{C}_{\mathrm{e}}$

Freundlich等温吸附模型：$\mathrm{l}\mathrm{n}{Q}_{\mathrm{e}}=\frac{\mathrm{1}}{\mathrm{n}}\mathrm{l}\mathrm{n}{C}_{\mathrm{e}}+\mathrm{l}\mathrm{n}{\mathrm{k}}_{\mathrm{f}}$

Temkin等温吸附模型：$Q_{\mathrm{e}}=\frac{\mathrm{R}T}{\mathrm{m}}\mathrm{l}\mathrm{n}{C}_{\mathrm{e}}+\frac{\mathrm{R}T}{\mathrm{m}}\mathrm{l}\mathrm{n}\mathrm{a}$

式中：C_e为浓度，mg/L；Q_e为吸附量，mg/g；Q_m为饱和吸附量，mg/g；b为Langmuir常数，L/mg；n为Freundlich方程的异质性因子；k_f为Freundlich吸附系数，mg/g；R为理想气体常数，8.314 J/（K·mol）；T为温度，K；m为Temkin吸附平衡常数；a为Temkin吸附平衡常数。

采用准一级动力学、准二级动力学和颗粒内扩散模型对吸附动力学数据进行模型拟合。各动力学模型方程如下：

准一级动力学模型：$\mathrm{l}\mathrm{n}\left(Q_{\mathrm{e}}-Q_{\mathrm{t}}\right)=\mathrm{l}\mathrm{n}{Q}_{\mathrm{e}\mathrm{i}}-{\mathrm{k}}_{\mathrm{1}}t$

准二级动力学模型：$\frac{t}{Q_{\mathrm{t}}}=\frac{\mathrm{1}}{{\mathrm{k}}_{\mathrm{2}}{Q}_{\mathrm{e}\mathrm{i}}^{\mathrm{2}}}+\frac{t}{Q_{\mathrm{e}\mathrm{i}}}$

颗粒内扩散模型：$Q_{\mathrm{t}}=\mathrm{C}+{\mathrm{k}}_{\mathrm{i}\mathrm{d}}{t}^{\mathrm{1}/\mathrm{2}}$

式中：Q_t为t时刻时的吸附量，mg/g；Q_ei为吸附平衡时的理论饱和吸附量，mg/g；k₁为准一级速率方程常数，min^-1；k₂为准二级速率方程常数，g/（mg·min）；t为吸附时间，min；C为颗粒内扩散模型常数，mg/g；k_id为内扩散速率常数，mg/（g·min^1/2）；t^1/2为时间的平方根，min^1/2。

采用透析袋法评价载药体系体外释放情况。将10 mL含有8 mg载药体系的混悬液，装入预活化的透析袋中。透析袋置入40 mL的磷酸缓冲盐溶液（PBS；pH 7.4、6.5、5.5），在不同温度（25、35、45 ℃）恒温水浴中以120 r/min的速度振摇72 h。在0.5、1、1.5、2……72 h分别取出3 mL释放介质用紫外可见分光光度计测量373 nm下的吸光度，补充对应pH等体积PBS介质。每个实验都重复3次，计算槲皮素累积释放率并进行分析。

载药量和包封率按照如下公式进行计算：

MMS的SEM图如图2（a）所示。结果表明，掺锰介孔二氧化硅为球形，粒径分布均匀并具有良好的分散性。通过DLS试验进一步证实了MMS的均匀性，如图2（b）所示，MMS的粒径较窄（在100~150 nm之间），这种窄峰形也表明MMS的粒径相对均匀。

图2  含锰二氧化硅纳米球（MMS）的扫描电镜及粒径分布情况

注：  （a）为扫描电镜图；（b）为粒径分布曲线。

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为了证明锰的成功掺杂，用XPS对MMS样品进行表征，分析了锰的状态。如图3（a）所示，Mn2p轨道在641.4、645.5、653.1 eV处分别出现了3个特征峰。在641.4、645.5 eV处的两个峰属于Mn2p_3/2轨道^［

图3  样品的谱图

注：  （a）为MMS的X射线光电子能谱（XPS）图；（b）为MMS和MMS-QUE-CMCS中O、N和Si高分辨能谱图；MMS为含锰二氧化硅纳米球；MMS-QUE-CMCS为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系；Mn为锰。

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从图4对MMS进行的SEM图和相应元素面分布图可以看出，MMS中含有硅、氧和锰元素，且锰元素分布与硅、氧的分布一致，表明锰已成功掺杂到二氧化硅中。相应的能谱仪（EDS）光谱也证实了MMS中含有硅、氧和锰元素，锰掺杂量为17.3%（质量比）^［

图4  含锰二氧化硅纳米球（MMS）的表征

注：  a为扫描电镜图；b、c、d为元素面分布图；e为能谱仪（EDS）光谱图。

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MMS负载槲皮素前后的TEM图如图5所示，可见MMS为均匀球形，粒径在140~175 nm之间。当MMS装载槲皮素后，MMS内的孔因被槲皮素填充而变得模糊不清，MMS-QUE-CMCS的粒径在180~280 nm之间，比MMS的粒径要大。与掺杂前的MMS相比，MMS-QUE-CMCS因负载槲皮素和被CMCS包覆而具有明显的核壳结构。

图5  样品的透射电镜（TEM）图

注：  a为含锰二氧化硅纳米球（MMS）；b为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系（MMS-QUE-CMCS）。

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图6给出了MMS、MMS-QUE和MMS-QUE-CMCS的XRD图。主峰22.5°可标记为非晶态二氧化硅^［

图6  样品的X射线衍射图（XRD）

注：  a为含锰二氧化硅纳米球（MMS）；b为负载槲皮素的二氧化硅（MMS-QUE）；c为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系（MMS-QUE-CMCS）。

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Zeta电势可用于评价MMS纳米颗粒之间的静电斥力，继而研究MMS在悬浮液中的稳定性^［

图7  MMS、MMS⁃NH₂、MMS⁃QUE和MMS⁃QUE⁃CMCS的Zeta电位图

注：  MMS为含锰二氧化硅纳米球；MMS-NH₂为氨基化含锰二氧化硅纳米球；MMS-QUE为负载槲皮素的二氧化硅；MMS-QUE-CMCS为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系。

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如图8所示，将MMS，MMS-QUE和MMS-QUE-CMCS以10 ℃/min的速度从室温加热到800 ℃，在这个过程中，3种样品均表现出一定程度的持续失重状态。加热过程中MMS由于其表面和内部的水分子释放，其质量损失表现在室温到800 ℃之间较宽的温度范围，总失重约为13.81%，而MMS-QUE的总失重约为16.97%，MMS-QUE-CMCS的总失重约为25.93%。MMS-QUE-CMCS具有较高的总失重，这是由于在加热过程中槲皮素和CMCS的损失。

图8  样品热重曲线图

注：  a为含锰二氧化硅纳米球（MMS）；b为负载槲皮素的二氧化硅（MMS-QUE）；c为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系（MMS-QUE-CMCS）。

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采用N₂吸附法确定样品的比表面积、孔体积和孔径，MMS负载槲皮素前后的N₂吸附-解吸等温线见图9。MMS和MMS-QUE-CMCS都具有H₂型滞回环的Ⅳ型等温线。MMS的比表面积为922.21 m²/g，孔体积为0.257 cm³/g，说明MMS适合作为药物载体。与MMS相比，MMS-QUE-CMCS的比表面积为164.04 m²/g，孔体积为0.151 cm³/g。相比于MMS，MMS-QUE-CMCS的孔表面积和孔体积减小，表明槲皮素已成功加载到载体MMS的孔隙中。

图9  样品的N₂吸附/解吸等温线图

注：  a为含锰二氧化硅纳米球（MMS）；b为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系（MMS-QUE-CMCS）。

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MMS和MMS-QUE-CMCS的孔径分布曲线表明，MMS具有较窄的孔径分布，为3~5 nm之间，这种狭窄的峰形表明MMS的孔径分布比较均匀。与MMS相比，MMS-QUE-CMCS的孔径分布没有明显的变化，这说明槲皮素的负载和CMCS的包封对MMS的孔径影响不是很大。见图10。

图10  样品的孔径分布曲线图

注：  a为含锰二氧化硅纳米球（MMS）；b为装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系（MMS-QUE-CMCS）。

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在20～300 mg/L的浓度范围内，随着槲皮素浓度的增加，载体吸附槲皮素的量增加，25 ℃、35 ℃和45 ℃都遵循这个规律。在相同的槲皮素浓度下，载体对槲皮素的吸附按照25 ℃>35 ℃>45 ℃的顺序减小，且均在槲皮素浓度达到280 mg/L时，平衡吸附量最大，25 ℃、35 ℃和45 ℃的平衡吸附量最大值分别是228 mg/g、220 mg/g和207 mg/g。见图11。

图11  氨基化含锰二氧化硅的等温吸附曲线图

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采用Langmuir、Freundlich和Temkin吸附热力学模型对数据进行拟合，结果显示Freundlich等温吸附模型线性拟合程度优于Langmuir和Temkin等温吸附模型。Freundlich等温吸附模型线性拟合曲线的R²值明显高于Langmuir和Temkin等温吸附模型线性拟合曲线的R²值。Freundlich等温吸附模型理论吸附量与实际值相接近，表明MMS-NH₂对槲皮素的吸附更接近于Freundlich等温吸附模型。见表1、表2、表3。

表1  兰缪尔（Langmuir）等温吸附模型相关参数

温度/℃	b/（L·mg-1）	Qm/（mg·g-1）	R2	线性方程
25	0.000 857 5	1 111.111 1	0.979 4	Ce/Qe=1.049 6+0.000 9Ce
35	0.002 211	476.190 5	0.689 4	Ce/Qe=0.950 0+0.002 1Ce
45	0.005 309	192.307 7	0.649 1	Ce/Qe=0.979 4+0.005 2Ce

注：  Q_m为饱和吸附量，b为Langmuir常数，R为理想气体常数，Ce为浓度，Q_e为吸附量。

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表2  弗伦德利希（Freundlich）等温吸附模型相关参数

温度/℃	kf/（mg·g-1）	1/n	R2	线性方程
25	0.763 1	1.026 5	0.994 6	lnQe=1.026 5lnCe-0.270 4
35	0.311 6	1.189 3	0.990 7	lnQe=1.189 3lnCe-1.166 1
45	0.176 8	1.277 3	0.982 3	lnQe=1.277 3lnCe-1.732 8

注：  Q_e为吸附量，C_e为浓度，k_f为Freundlich吸附系数，R为理想气体常数。

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表3  乔姆金（Temkin）等温吸附模型相关参数

温度/℃	m	a	R2	线性方程
25	28.255 4	0.038 01	0.913 7	Qe=-286.72+87.685lnCe
35	21.252 5	0.029 05	0.815 0	Qe=-426.40+120.490lnCe
45	32.781 8	0.033 78	0.896 3	Qe=-273.23+80.650lnCe

注：  Q_e为吸附量，C_e为浓度，m为Temkin吸附平衡常数；a为Temkin吸附平衡常数。

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随着吸附时间的增加，对槲皮素的吸附先快速增加后逐渐平稳，最后在40 min时达到吸附平衡，25 ℃、35 ℃、45 ℃下均遵循这个变化趋势。相同时间内，对槲皮素的吸附量按照25 ℃>35 ℃>45 ℃的顺序逐渐降低。从热力学和动力学吸附数据来看都是25 ℃比较适合MMS-NH₂吸附槲皮素，因此该载体适合于实际生产应用。见图12。

图12  氨基化含锰二氧化硅纳米载体对槲皮素的吸附动力学曲线图

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采用准一级动力学模型、准二级动力学模型和颗粒内扩散模型对动力学数据进行拟合分析，结果发现对槲皮素吸附的准二级动力学模型线性拟合程度明显优于准一级动力学模型和颗粒内扩散模型。25 ℃、35 ℃和45℃的拟合结果均是如此。准二级动力学模型拟合的R²值高于准一级动力学模型和颗粒内扩散模型拟合的R²值，且准二级动力学模型的理论计算值Q_ei更接近于实际值。所以，对槲皮素的吸附过程更符合准二级动力学模型，属于化学吸附。见表4。

表4  吸附动力学相关参数

温度/℃	准一级动力学			准二级动力学			颗粒内扩散
	Qei/（mg·g-1）	k1	R2	Qei（mg/g）	k2	R2	kid［mg/（g·min1/2）］	C（mg/g）	R2
25	101.473 7	0.022 8	0.859 5	208.333 3	0.001 936	0.998 9	14.469	97.037	0.902 5
35	114.823 9	0.018 8	0.851 7	196.078 4	0.001 486	0.997 9	15.002	81.636	0.902 2
45	143.739 1	0.016 4	0.914 0	185.185 2	0.000 965 6	0.994 2	15.994	55.140	0.955 2

注：  Q_ei为吸附平衡时的理论饱和吸附量，k₁为准一级速率方程常数， k₂为准二级速率方程常数，C为颗粒内扩散模型常数，k_id为内扩散速率常数，R为理想气体常数。

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介孔二氧化硅纳米粒子具有较高的比表面积和孔径，所以二氧化硅很容易吸附和负载槲皮素。制备的MMS-NH₂吸附槲皮素的包封率为98.94%，载药量达到37.56%。该载体在负载槲皮素方面比文献报道的（聚N-异丙基丙烯酰胺）凝胶纳米载体（载药量为3.18%）高很多，体现出MMS在载药方面有一定的优势。

MMS-QUE-CMCS在不同pH条件下槲皮素的释放情况见图13。槲皮素开始释放的50 h内，在不同pH值条件下（5.5，6.5，7.4），MMS-QUE-CMCS的累计释放量分别为62.98%、92.53%和82.00%。介孔二氧化硅载体的主要问题之一是生物降解性低。硅氧骨架非常稳定，在生理条件下二氧化硅的降解相对困难，因此导致体内生物蓄积和潜在的生物安全风险。掺锰二氧化硅具有较高的药物释放量，一方面可提高二氧化硅纳米载体的生物降解性，另一方面锰是人体新陈代谢的重要微量元素之一^［

图13  装载槲皮素且经羧甲基壳聚糖封堵的载药体系在不同pH下的释药动力学曲线图

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