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基于网络药理学及体外实验验证探讨黄连素治疗非酒精性脂肪性肝炎的作用机制
中医药治疗优势病种与重大疾病研究：慢性肝病专题 | 更新时间：2023-05-16
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    • 基于网络药理学及体外实验验证探讨黄连素治疗非酒精性脂肪性肝炎的作用机制

    • Mechanism analysis of berberine in the treatment of nonalcoholic steatohepatitis based on network pharmacology and in vitro experimental verification

    • 黄燕萍

      ，  

      伍月兰

      ，  

      孙明瑜

      ，  

      张琴

      ，  
    • 上海中医药杂志   2023年57卷第5期 页码：12-19

    • DOI：10.16305/j.1007-1334.2023.2208001    

      中图分类号：

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  • 黄燕萍,伍月兰,孙明瑜,等.基于网络药理学及体外实验验证探讨黄连素治疗非酒精性脂肪性肝炎的作用机制[J].上海中医药杂志,2023,57(5):12-19. DOI： 10.16305/j.1007-1334.2023.2208001.

    HUANG Yanping,WU Yuelan,SUN Mingyu,et al.Mechanism analysis of berberine in the treatment of nonalcoholic steatohepatitis based on network pharmacology and in vitro experimental verification[J].Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine,2023,57(5):12-19. DOI： 10.16305/j.1007-1334.2023.2208001.

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    摘要

    目的

    借助网络药理学、分子对接技术及体外细胞实验探讨黄连素治疗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的潜在作用机制，为临床用药提供理论依据。

    方法

    借助中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）获取黄连素的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特征性信息，采用毒物基因组学数据库（CTD）、人类基因综合数据库（GeneCards）筛选黄连素靶点基因及NASH相关基因，并借助Bioinformatics工具获得基因交集；采用Cytoscape v3.6.1软件构建“黄连素-目标基因-通路”网络，进行基因互作网络分析、功能富集分析，以确定黄连素治疗NASH的关键基因。使用webina分子对接技术评估黄连素与关键基因靶点的结合能力。取对数生长期的小鼠正常肝细胞（AML12），分为空白组、模型组和黄连素各剂量组，各组给予相应干预，实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）法检测验证相关作用靶点。

    结果

    黄连素治疗NASH的关键基因有白介素-10（IL-10）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、血红素加氧酶1（HMOX1）、CC趋化因子配体2（CCL2）、重组人白介素8（CXCL8）、Toll样受体4（TLR4）、JUN原癌基因（JUN）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素-6（IL-6）等，分子对接结果表明黄连素与TLR4、CCL2、MMP9、CXCL8蛋白具有良好的结合性能。体外细胞实验结果表明，与空白组比较，模型组PTGS2、CCL2和TLR4 mRNA表达升高（P<0.01）；与模型组比较，黄连素各剂量组PTGS2、CCL2和TLR4 mRNA表达降低（P<0.01），呈现剂量依赖趋势。

    结论

    黄连素可以靶向调控NASH发生发展过程中的关键分子构成的网络，进而发挥系统药理作用。

    Abstract

    Objective

    To explore the potential mechanism of berberine in the treatment of nonalcoholic steatohepatitis（NASH） based on network pharmacology， molecular docking and in vitro cell experiments， and to provide a theoretical basis for clinical application.

    译

    Methods

    Characteristic information of absorption， distribution， metabolism， and excretion of berberine was obtained from the Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database （TCMSP）. The potential target genes of berberine and NASH-related genes were obtained from Comparative Toxicogenomics Database （CTD） and the GeneCards human gene database （GeneCards）. The gene intersections were obtained with the Bioinformatics tool. Cytoscape v3.6.1 was used to construct a “safranin-target gene-pathway” network， and gene-gene interaction network analysis and functional enrichment analysis were performed to identify the key genes of berberine for NASH treatment. Molecular docking technology was used to evaluate the binding ability of berberine to key gene targets via webina. Normal hepatocytes （AML12） of mice at logarithmic growth stage were divided into blank group， model group and each dose group of berberine， and each group was given the corresponding intervention. The relevant target genes were verified by RT-qPCR assay.

    译

    Results

    The network analysis showed that the key genes of berberine for NASH treatment were interleukin-10 （IL-10）， prostaglandin endoperoxide synthase 2 （PTGS2）， heme oxygenase 1 （HMOX1）， CC chemokine ligand 2 （CCL2）， recombinant human interleukin 8 （CXCL8）， Toll-like receptor 4 （TLR4）， Jun proto-oncogene （JUN）， matrix metalloproteinase 9 （MMP9）， tumor necrosis factor （TNF） and interleukin-6 （IL-6）. The molecular docking results showed that berberine had good binding properties with TLR4， CCL2， MMP9 and CXCL8 proteins. The results of in vitro cell experiments showed that PTGS2， CCL2 and TLR4 mRNA were highly expressed in the model （P<0.01）； and PTGS2， CCL2 and TLR4 mRNA were lowly expressed in each dose group （P<0.01）， showing a dose-dependent trend.

    译

    Conclusion

    Berberine can exert systemic pharmacological effects by regulating a network of key molecules in the occurrence and development of NASH.

    译

    非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是由多种因素导致的肝脏疾病，其特征为肝细胞脂肪变性和肝细胞损伤，伴或不伴肝纤维化，与心脑血管疾病、肝硬化、肝细胞癌的发生密切相关。NASH的发病是多种病理过程共同作用的结果，如脂毒性、氧化应激、免疫细胞调控失常、肝细胞凋亡，涉及多个靶点，最终导致肝免疫细胞浸润和炎症，肝星状细胞激活［

    1-3］。临床首选生活方式干预治疗本病，但多数患者无法从中获益，需采用药物治疗。然受限于“一种基因，一种药物，一种疾病”思维，临床尚无合适的单一药物治疗本病，因此具有实质药理活性的多靶点天然产物具有潜在优势［4］。

    黄连素对糖脂代谢有独特的药理作用，如抗氧化、抗炎、肝细胞保护，可有效治疗糖尿病、脂肪肝，临床应用广泛［

    5-9］，但其发挥作用的具体机制尚不清楚。本研究借助网络药理学、分子对接技术、体外细胞实验探讨黄连素治疗NASH的潜在机制，以期为黄连素的临床应用及NASH的防治研究提供参考。

    1 资料与方法

    1.1 化学成分的收集与筛选

    采用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/）［

    10］获取黄连素的药代动力学参数，以及吸收、分布、代谢和排泄（absorption、distribution、metabolism、excretion，ADME）特征性信息 ［11-12］。

    1.2 潜在靶点的预测

    通过比较毒物基因组学数据库（CTD，http：//ctdbase.org/）［

    13］筛选黄连素的候选靶基因，设置阈值化学-基因相互作用≥1，并去除非人源基因。在人类基因综合数据库（GeneCards，https：//www.genecards.org）中搜索“non-alcoholic steatohepatitis”以获得NASH相关基因。借助Bioinformatics工具获得黄连素靶基因与NASH相关基因的交集，即为黄连素靶向NASH的基因。

    1.3 “黄连素-目标基因-通路”网络的构建与分析

    使用Cytoscape v3.6.1软件（https：//www.nigms.nih.gov/）构建“黄连素-目标基因-通路”网络图。

    1.4 基因互作网络分析

    将靶基因导入GeneMANIA（http：//www.genemania.org）和String（https：//string-db.org）数据库，分析黄连素作用于NASH的相关基因，探讨基因互作网络关系并得到网络中的hub基因。

    1.5 靶点的通路分析

    借助WebGestalt（http：//www.webgestalt.org）数据库对靶基因进行基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因探针（GSEA）通路富集分析［

    14］。

    1.6 分子对接

    使用webina数据库（https：//durrantlab.pitt.edu/webina/） ［

    15］进行分子对接，上传PDB 格式的候选基因的晶体结构和黄连素MOL2格式信息至webina，相关参数均设置为默认值，用于分析黄连素与多种蛋白的结合潜力。

    1.7 体外细胞实验验证

    1.7.1 细胞培养与干预

    小鼠正常肝细胞（AML12）购自美国菌种保藏中心（ATCC）（批号：CRL-2254），采用含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素的DMEM/F12基础培养基进行培养，培养条件为37 ℃、5%CO2。

    1.7.2 药物与试剂

    黄连素，美国TargetMol公司（批号：T4S0797）；DMEM/F12基础培养基，中国中乔新舟生物科技有限公司（批号：ZQ-606）； 二甲基亚砜（DMSO），美国Sigma-Aldrich公司（批号：C6164-50ML）；TRIzol，生工生物工程（上海）股份有限公司（批号：B511311-0100）；RNA反转录试剂盒、荧光定量试剂盒，日本Takara株式会社（批号分别为RR047B、RR820B）。

    1.7.3 主要仪器

    PCR热循环仪（型号：A24811）、实时荧光定量PCR仪（型号：A31665），美国Thermo Fisher公司。

    1.7.4 细胞分组与干预

    AML12细胞密度达80%～90%后传代培养于含有棕榈酸（PA）200 μmol/L的培养基中，设为模型组；在此基础上，给予梯度浓度的黄连素（6.25、12.5、25、50 μmol/L）进行干预，分别设为黄连素6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L组；另取AML12细胞培养于不含PA的正常培养基中，正常培养不予处理，设为空白组。各组均培养诱导24 h，用于后续实验。

    1.7.5 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）法检测相关基因表达

    取适量AML12细胞并转移至EP管中，加入TRIzol提取总RNA，加入逆转录酶进行逆转录制备cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）为内参进行PCR扩增，检测各组AML12细胞中前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、CC趋化因子配体2（CCL2）和Toll样受体4（TLR4）mRNA的表达水平。反应条件：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s；40个循环。扩增引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列见表1。各组均设3个复孔。以2-ΔΔCt法表示PTGS2、CCL2和TLR4 mRNA的相对表达量。

    表1  引物序列
    基因名称序列长度/bp
    PTGS2 F：5'-TGCACTATGGTTACAAAAGCTGG-3' 23
    R：5'-TCAGGAAGCTCCTTATTTCCCTT-3' 23
    CCL2 F：5'-TAAAAACCTGGATCGGAACCAAA-3' 23
    R：5'-GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT-3' 23
    TLR4 F：5'-AAATGCACTGAGCTTTAGTGGT-3' 22
    R：5'-TGGCACTCATAATGATGGCAC-3' 21
    GAPDH F：5'-AGGAGTAAGAAACCCTGGAC-3' 20
    R：5'-CTGGGATGGAATTGTGAG-3' 18

    注：  PTGS2为前列腺素内过氧化物合酶2基因，CCL2为CC趋化因子配体2基因，TLR4为Toll样受体4基因，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。

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    1.8 统计学方法

    所有分析均使用所用工具的默认值进行。计量资料以ˉx±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。CTD的查询结果中仅显示得分≥1的预测候选目标蛋白。所有报告的P值均为双尾，以P<0.01为差异有统计学意义。

    2 结果

    2.1 黄连素的药代动力学特性

    借助TCMSP共得到黄连素的12种AMDE特性。见表2。

    表2  黄连素的药理和分子特性
    项目特征值
    MW/Da 336.39
    AlogP 3.45
    Hdon 0.00
    Hacc 4.00
    OB/% 36.86
    Caco-2 1.24
    BBB 0.57
    DL 0.78
    FASA- 0.19
    TPSA 40.80
    RBN 2.00
    HL/h 6.57

    注：  MW为分子量，AlogP为油水分配系数，Hdon为氢键供体，Hacc为氢键受体，OB为口服生物利用度，Caco-2为肠上皮渗透性，BBB为血脑屏障，DL为类药性，FASA-为负表面积，TPSA为化合物极性，RBN为化合物中可旋转键的个数，HL为药物半衰期。

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    2.2 潜在靶点的预测

    借助CTD数据库筛选黄连素的靶基因，去除非人源基因后，共得到250个黄连素作用的靶基因。借助GeneCards数据库共得到NASH相关基因501个。通过Bioinformatics工具获得黄连素靶基因与NASH相关基因的交集，即为黄连素靶向NASH的基因，主要包括炎症因子及转录因子。见表3、图1。

    表3  黄连素靶向非酒精性脂肪性肝炎的基因（度数前10者）
    英文缩写中文全称度数
    IL-10 白介素-10基因 9.615 4
    PTGS2 前列腺素内过氧化物合酶2基因 9.615 4
    HMOX1 血红素加氧酶1基因 9.615 4
    CCL2 趋化因子配体2基因 8.952 4
    CXCL8 重组人白介素8基因 8.952 4
    TLR4 Toll样受体4基因 8.382 4
    JUN JUN原癌基因 8.039 2
    MMP9 基质金属蛋白酶9基因 7.777 8
    TNF 肿瘤坏死因子基因 7.333 3
    IL-6 白介素-6基因 6.153 8
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    fig

    图1  黄连素治疗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）靶点

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    2.3 “黄连素-目标基因-通路”网络的构建与分析

    根据目标和途径分析，我们借助Cytoscape v3.6.1软件构建了“黄连素-目标基因-通路”网络，包括65个节点和217个边缘。见图2。

    fig

    图2  “黄连素-目标基因-通路”网络图

    注：  图中红色的长方形、蓝紫色的倒三角形和绿色的椭圆分别对应黄连素、目标基因和通路。

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    2.4 基因互作网络分析

    将靶基因导入GeneMANIA，发现37.05%的基因具有物理相互作用，20.16%发挥了共定位作用，19.43%具有相似的共表达特性，其他还有相关途径、共有的蛋白质结构域和遗传相互作用。见图3。

    fig

    图3  基因互作网络

    注：  图中连接颜色表示不同的相关性。纯黑色圆圈中的基因是查询词，带灰色条纹圆圈中的基因表示与查询基因相关的基因。

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    将靶基因导入String数据库（PPI得分>0.7）构建PPI网络，PPI网络由84个交互节点和517个交互边缘组成（见图4）。本研究选取了度数最大的10个节点作为关键基因，分别是白介素-10（IL-10）、PTGS2、血红素加氧酶1（HMOX1）、CCL2、重组人白介素8（CXCL8）、TLR4、JUN原癌基因（JUN）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素-6（IL-6）。见图5。

    fig

    图4  黄连素治疗非酒精性脂肪性肝炎的靶点基因互作网络示例

    注：  IL-10为白介素-10基因，PTGS2为前列腺素内过氧化物合酶2基因，HMOX1为血红素加氧酶1基因，CCL2为CC趋化因子配体2基因，CXCL8为重组人白介素8基因，TLR4为Toll样受体4基因，JUN 为JUN原癌基因，MMP9为基质金属蛋白酶9基因，TNF为肿瘤坏死因子基因，IL-6为白介素-6基因。

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    fig

    图5  黄连素治疗非酒精性脂肪性肝炎的靶基因

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    2.5 靶点的通路分析

    如图6所示，GO分析富集在前面的功能分别是炎症反应（GO：0006954）、外部刺激反应的调节（GO：0032101）、蛋白质代谢过程的负调控（GO：0051248）、压力反应的调节（GO：0080134）、细胞蛋白质代谢过程的负调控（GO：0032269）、免疫系统过程的调控（GO：0002682）、分子功能正调控（GO：0044093）、防御反应（GO：0006952）、细胞内信号转导的调控（GO：1902531），这些功能性术语与脂代谢、抗炎反应高度相关。

    fig

    图6  黄连素治疗非酒精性脂肪性肝炎靶点的GO富集分析

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    KEGG通路分析显示，靶基因显著富集在AGE-RAGE糖尿病并发症的信号通路（hsa04933）及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）（hsa04932）、胰岛素抵抗（hsa04931）、动脉粥样硬化的流体剪切力（hsa05418）、乙型肝炎（hsa05161）等通路。NASH的主要病理是肝细胞脂肪变和炎症，伴有肝细胞的坏死和炎症细胞浸润。上述生物学过程或病理变化可能参与NASH的致病，而这些病理变化可采用黄连素进行治疗。见图7。

    fig

    图7  黄连素治疗非酒精性脂肪性肝炎靶点的KEGG通路分析

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    2.6 分子对接

    上传黄连素的MOL2结构信息至webina，用于分析其与IL-10、PTGS2、HMOX1、CCL2、CXCL8、TLR4、JUN、MMP9、TNF、IL-6的结合潜力。结果表明，黄连素与TLR4、CCL2、MMP9、CXCL8蛋白之间存在强相互作用，提示黄连素对NASH具有治疗作用。见图8。

    fig

    图8  分子对接示意图

    注：  TLR4为Toll样受体4，CCL2为CC趋化因子配体2，MMP9为基质金属蛋白酶9，CXCL8为重组人白介素8。

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    2.7 体外细胞实验验证

    体外细胞实验结果显示，与空白组比较，模型组PTGS2、CCL2和TLR4 mRNA表达升高（P<0.01）；与模型组比较，黄连素各剂量组PTGS2、CCL2和TLR4 mRNA表达降低（P<0.01），并呈现剂量依赖趋势。见图9。

    fig

    图9  黄连素对小鼠正常肝细胞相关基因表达的影响

    注：  TLR4为Toll 样受体4基因，CCL2为CC趋化因子配体2基因，PTGS2为前列腺素内过氧化物合酶2基因。BBR为黄连素（代表黄连素各剂量组，μmol/L）。与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。用2-ΔΔCt法表示基因的相对表达量。n=3，ˉx±s。

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    3 讨论

    NASH是造成肝脏损伤、肝脏不良结局的常见疾病，近年来其患病率呈不断上升趋势［

    16］。深入了解疾病的病因和发病机制十分必要，网络药理学为中药多成分、多途径和多靶点的作用机制研究提供了参考［17］。药代动力学特性是药物最重要的特征［18］，Lipinski的5条规则认为，满足分子量介于180～500 Da、油水分配系数<5、氢键供体<5、氢键受体<10的化合物更具有可药性［19］。我们从TCMSP数据库中获得了黄连素的12个非常重要的药代动力学特性，满足Lipinski规则，这意味着黄连素治疗NASH具有一定的前景。

    在药物开发中，目标基因鉴定是第一步。本研究共鉴定出与NASH相关的基因501个，匹配后得到与黄连素靶点重叠的基因84个。GeneMANIA可以提供有关物理相互作用、共定位、共表达以及共有蛋白结构域的信息，由此提示靶标及其相互作用蛋白可能具有相同或相似的功能。为了更深入地了解黄连素对NASH的影响，我们对靶基因进行了GO功能分析和KEGG通路富集分析。GO分析结果表明，黄连素靶基因主要与炎症反应、应激反应过程、代谢过程的负调控及免疫系统的调控等相关。KEGG通路分析结果表明，黄连素靶基因显著富集在NAFLD信号通路、胰岛素抵抗信号通路、AMPK信号通路、乙型肝炎信号通路，上述途径参与了NASH进程中的关键步骤。已有研究［

    20-21］表明，黄连素可以通过激活凋亡途径发挥调节脂代谢、抗氧化、抗炎，甚至抗肿瘤等药理作用。脂肪肝及其并发症的发病机制复杂，多靶标的药物治疗更为有效。本研究中的药物目标网络揭示了黄连素具有多靶标、多层次作用的特点，具有多种药理活性。这与既往研究［22］结果一致，即黄连素可以通过靶向多种蛋白质和途径发挥系统的药理作用。

    已有研究证实，NASH患者的基因表达会发生变化，这些研究多聚焦在细胞或动物中基因的转录水平。PTGS2是合成前列腺的关键速率限制酶，也是重要的促炎因子和治疗炎症疾病的核心目标。PTGS2参与了NASH的发展，选择性PTGS2抑制剂可以显著改善NASH模型小鼠的肝脂肪变性、炎症和肝损伤；作为炎症和氧化应激的桥梁，PTGS2不仅能够产生炎症细胞因子，也是脂质代谢中的重要酶［

    23］。CCL2是CC趋化因子家族的小分子量细胞因子，在NASH的发展过程中，CCL2及其受体在肝脏中的水平上调，从而促进巨噬细胞的积聚，发生炎症、纤维化和脂肪变性，可见CCL2与肝脏炎症密切相关［24-25］。NASH患者的循环血CCL2水平持续升高，提示高CCL2水平可以促进NASH的进展［26-27］。TLR4是TLR家族中最有特色的成员，通常起模式识别受体的作用，与NASH的发病密切相关［28］。TLR4激活后，核因子（NF）-κB途径随之被一系列下游信号激活，从而产生促炎分子［29］。黄连素可以通过抑制TLR4活性来发挥肝脏保护作用［30-31］。本研究中的体外细胞实验结果显示，与空白组相比，模型组PTGS2、CCL2、TLR4 mRNA表达升高；黄连素干预后，PTGS2、CCL2、TLR4 mRNA表达呈现剂量依赖性降低，为临床用药提供理论了一定依据。

    综上，黄连素可以靶向调控NASH发生发展过程中的关键分子构成的网络，进而发挥系统药理作用，有望被开发为一种安全有效的抗NASH药物。

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