参苓白术散对大肠癌移植瘤模型小鼠化学疗法后肠道黏膜屏障的影响

汪舒云; 谢曼丽; 孙可向; 邓皖利

doi:10.16305/j.1007-1334.2023.2206070

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参苓白术散对大肠癌移植瘤模型小鼠化学疗法后肠道黏膜屏障的影响

中医药治疗优势病种与重大疾病研究：肿瘤疾病专题 | 更新时间：2023-04-08

- 参苓白术散对大肠癌移植瘤模型小鼠化学疗法后肠道黏膜屏障的影响
- Effect of Shenling Baizhu Powder on intestinal mucosal barrier in mice with xenograft model of colorectal cancer after chemotherapy
- 角色： First author , 第一作者 ,
  
  机构：
  上海中医药大学附属普陀医院中医肿瘤科（上海 200062）
  
  邮箱：
  
  简介：汪舒云，女，硕士研究生，主要从事中医药防治恶性肿瘤基础研究工作
  
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  汪舒云
  ，
  角色：
  
  机构：
  上海中医药大学附属普陀医院中医肿瘤科（上海 200062）
  
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  谢曼丽
  ，
  角色：
  
  机构：
  上海中医药大学附属普陀医院中医肿瘤科（上海 200062）
  
  邮箱：
  
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  孙可向
  ，
  角色： Corresponding author , 通讯作者 ,
  
  机构：
  上海中医药大学附属普陀医院中医肿瘤科（上海 200062）
  
  邮箱： dwl0707@163.com
  
  简介：邓皖利，教授，主任医师，博士研究生导师； E-mail：dwl0707@163.com
  
  暂无本作者相关信息
  邓皖利
  ，
- 上海中医药杂志 2023年57卷第4期页码：57-64
- 作者机构：
  
  1.上海中医药大学附属普陀医院中医肿瘤科（上海 200062）
- 作者简介：
  
  汪舒云，女，硕士研究生，主要从事中医药防治恶性肿瘤基础研究工作
  邓皖利，教授，主任医师，博士研究生导师； E-mail：dwl0707@163.com
- 基金信息：
  
  上海市卫健委上海市进一步加快中医药事业发展三年行动计划项目（ZY〔2021-2023〕-0302）;上海市卫健委中医药科研项目(2022QN052);上海市普陀区卫生健康系统科技创新项目(ptkwws202002);上海市普陀区卫生健康系统临床特色专科建设项目(2021tszk01);上海中医药大学2021年研究生创新创业项目(Y2021066)
- DOI：10.16305/j.1007-1334.2023.2206070
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汪舒云,谢曼丽,孙可向,等.参苓白术散对大肠癌移植瘤模型小鼠化学疗法后肠道黏膜屏障的影响[J].上海中医药杂志,2023,57(4):57-64.

WANG Shuyun,XIE Manli,SUN Kexiang,et al.Effect of Shenling Baizhu Powder on intestinal mucosal barrier in mice with xenograft model of colorectal cancer after chemotherapy[J].Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine,2023,57(4):57-64.
汪舒云,谢曼丽,孙可向,等.参苓白术散对大肠癌移植瘤模型小鼠化学疗法后肠道黏膜屏障的影响[J].上海中医药杂志,2023,57(4):57-64. DOI： 10.16305/j.1007-1334.2023.2206070.

WANG Shuyun,XIE Manli,SUN Kexiang,et al.Effect of Shenling Baizhu Powder on intestinal mucosal barrier in mice with xenograft model of colorectal cancer after chemotherapy[J].Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine,2023,57(4):57-64. DOI： 10.16305/j.1007-1334.2023.2206070.

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摘要

目的

观察参苓白术散对大肠癌移植瘤模型小鼠化学疗法（简称“化疗”）后肠道黏膜屏障的作用效果。

方法

将32只SPF级BALB/c小鼠皮下接种CT26肠癌细胞，成瘤后随机分为模型组、奥沙利铂组、参苓白术散组、参苓白术散联合奥沙利铂组，每组8只。模型组予蒸馏水灌胃（0.2 mL/次，1次/d），奥沙利铂组予奥沙利铂5 mg/kg腹腔注射（0.2 mL/次，每3天1次），参苓白术散组15.6 g/kg灌胃（0.2 mL/次，1次/d），参苓白术散联合奥沙利铂组予参苓白术散15.6 g/kg灌胃（0.2 mL/次，1次/d）联合奥沙利铂5 mg/kg腹腔注射（0.2 mL/次，每3天1次），共治疗18 d。治疗结束后每组选取8只小鼠采集血清，以酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）、白介素-17（IL-17）以及肠道黏膜中肠碱性磷酸酶（IAP）、肠黏膜分泌型免疫球蛋白A（sIgA）；剥取小鼠瘤体、脾脏并称重，通过苏木素-伊红（HE）染色法和免疫组织化学（IHC）染色法在组织形态学上分析参苓白术散对小鼠肠道黏膜的影响，并通过流式细胞术检测肿瘤组织中免疫微环境的变化情况。

结果

与模型组比较，参苓白术散组、奥沙利铂组以及参苓白术散联合奥沙利铂组均能抑制肿瘤的生长，其中参苓白术散联合奥沙利铂能显著抑制肿瘤的生长（P<0.05）；奥沙利铂单独治疗能显著降低肠IAP的表达（P<0.05），同时可以显著升高D-LA（P<0.05）和DAO的表达水平（P<0.05）。HE染色结果表明，参苓白术散可以显著修复化疗之后结肠绒毛的组织学排列，并且减少炎症反应发生。IHC染色结果表明，参苓白术散能显著提高化疗后小鼠结肠紧密连接蛋白闭合蛋白（claudin）、咬合蛋白（occludin）和闭锁小带蛋白-1（ZO-1）的表达水平。和奥沙利铂相比，参苓白术散联合奥沙利铂能缓解肠道黏膜的屏障损伤，一定程度修复化疗引起的肠道黏膜屏障损伤。另一方面，参苓白术散能增加肿瘤微环境中CD8⁺T细胞的浸润。

结论

参苓白术散能够保护化疗后肠黏膜屏障，改善肿瘤免疫微环境，从而抑制小鼠皮下移植瘤的生长。

Abstract

Objective

To observe the effect of Shenling Baizhu Powder （SLBZ） on intestinal mucosal barrier in mice with xenograft model of colorectal cancer after chemotherapy.

译

Methods

Thirty-two SPF grade BALB/c mice were subcutaneously inoculated with CT26 colorectal carcinoma cells， and after tumor formation they were randomly divided into four groups （n=8 each）： model group， oxaliplatin group， SLBZ group， and SLBZ plus oxaliplatin group. Mice in the model group were given distilled water by gavage （0.2 mL， once daily）， mice in the oxaliplatin group were treated with intraperitoneal injection of 5 mg/kg oxaliplatin （0.2 mL， once every 3 days）， mice in the SLBZ group were treated with 15.6 g/kg SLBZ by gavage （0.2 mL， once daily）， and mice in the SLBZ plus oxaliplatin group were treated with 15.6 g/kg SLBZ by gavage （0.2 mL， once daily） and intraperitoneal injection of 5 mg/kg oxaliplatin （0.2 mL， once every 3 days）. The treatment lasted for 18 days. At the end of treatment，8 mice in each group were selected for serum collection， and the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect serum diamine oxidase （DAO）， D-lactic acid （D-LA）， interleukin-17 （IL-17）， intestinal alkaline phosphatase （IAP） and intestinal mucosal secretory immunoglobulin A （sIgA）. The tumors and spleens of the mice were excised and weighed. Hematoxylin and Eosin （HE） staining and Immunohistochemistry （IHC） staining were used to analyze the effect of SLBZ on intestinal mucosa of mice in histomorphology， and flow cytometry was used to detect the changes of immune microenvironment in tumor tissues.

译

Results

Compared with the tumor growth condition in the model group， the tumor growth was inhibited in SLBZ group and oxaliplatin group， and significantly inhibited in SLBZ plus oxaliplatin group （P<0.05）. Oxaliplatin treatment alone significantly decreased the expression of IAP （P<0.05）， and significantly increased the expression of D-LA （P<0.05） and DAO （P<0.05）. The results of HE staining showed that SLBZ could significantly repair the histological arrangement of colonic villi after chemotherapy and reduce the occurrence of inflammatory reactions. The results of IHC staining showed that SLBZ could significantly increase the expression of colonic tight junction proteins （claudin）， occludin and zonula occludens-1 （ZO-1） in colon of mice after chemotherapy. Compared with the effect of oxaliplatin treatment alone， SLBZ plus oxaliplatin could alleviate the intestinal mucosa barrier damage， and repair the chemotherapy-induced intestinal mucosal barrier damage to a certain extent. Meanwhile， SLBZ could increase the CD8⁺ T cell infiltration in the tumor microenvironment.

译

Conclusion

SLBZ can protect the intestinal mucosal barrier after chemotherapy and improve the tumor immune microenvironment， thereby inhibiting the growth of subcutaneously xenograft tumors in mice.

译

关键词

大肠癌; 经典名方; 肠道黏膜屏障; 肿瘤微环境; 化学疗法; 模型小鼠; 中药研究

Keywords

colorectal cancer; Chinese classic formulas; intestinal mucosal barrier; tumor microenvironment; chemotherapy; mouse model; traditional Chinese herbal medicine research

译

大肠癌包括结肠癌和直肠癌，是临床常见的恶性肿瘤之一^［

1］。大肠癌的治疗手段有手术切除、化学疗法（简称“化疗”）、放射治疗（简称“放疗”）、免疫治疗、细胞治疗以及靶向治疗^{［参考文献 2-4

2-4］}。然而，每种治疗方案都有副作用，而且每种疗法都有缺点，如易出现肿瘤复发、靶点缺乏特异性以及抗癌药物的耐药性。长期的化疗可损害机体的正常反应，破坏机体内环境平衡，损伤大肠癌患者的肠道屏障，产生毒副反应及耐药现象，甚至引起大肠癌复发转移，致使病情更加恶化。

大肠癌属于中医学“积聚”“肠覃”“锁肛痔”等范畴，其发生、发展与脾虚密切相关，脾虚是大肠癌主要病因病机之一。在长期的化疗过程中，饮食减少、情志失调会进一步损伤机体正气。肠道屏障损伤与大肠癌的发生发展密切相关，同时化疗会进一步损伤肠道屏障^［

5］。肠道屏障功能是指肠道上皮具有分隔肠腔内物质、防止致病性抗原侵入的功能，包括机械性屏障、免疫性屏障和菌群屏障^{［参考文献 6

百度学术

6］}。长期的临床实践证明，中医药对肠道黏膜屏障功能具有明显的保护作用，中药经典名方参苓白术散为健脾渗湿止泻的常用方，其功用为益气健脾、渗湿止泻，临床上对于大肠癌化疗具有较好的减毒增效作用。本研究采用CT26大肠癌移植瘤模型小鼠，观察参苓白术散对大肠癌移植瘤化疗后肠道黏膜屏障的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级BALB/c小鼠，雌性，32只，6周龄，体质量18～20 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。动物生产合格证号：SCXK（沪）2017-0005。小鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心。动物使用许可证号：SYXK（沪）2020-0009。饲养期间各组小鼠均自由饮水、进食，饲养环境为昼夜各半循环照明，相对湿度为45%～65%，环境温度为21～25 ℃。所有操作方案均经上海中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批准号：PZSHUTCM210115018）。

1.1.2 细胞

CT26小鼠结肠癌细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.1.3 药物与试剂

参苓白术散颗粒剂：人参20 g、白术20 g、茯苓20 g、甘草20 g，白扁豆15 g，薏苡仁10 g、山药10 g、砂仁10 g、桔梗10 g、莲子10 g。本实验主要采用中药颗粒剂，参苓白术散生药共计145 g/剂，根据颗粒剂说明书与生药等量换算，相当于免煎颗粒75 g/剂。中药免煎颗粒由江阴天江药业有限公司提供。

奥沙利铂注射液，江苏恒瑞医药股份有限公司（批号：190328AA）。使用前用5%葡萄糖溶液配制成100 mL浓度为0.5 g/L的奥沙利铂注射用溶液，4 ℃保存备用。

闭合蛋白（claudin），美国Proteintech公司（批号：28674-1-AP）；咬合蛋白（occludin），美国CST公司（批号：91131S）；闭锁小带蛋白-1（ZO-1），美国Thermo Fisher Scientific公司（批号：33-9100）。

1.1.4 主要仪器

37 ℃、5%CO₂细胞培养箱，美国Thermo Fisher Scientific公司（型号：Heracell 150i MD）；离心机，德国Eppenddorf公司（型号：5810R）；超净工作台，新加坡ESCO公司（型号：ACB-4A1）；荧光倒置显微镜，日本Olympus株式会社（型号：CKX41）；全自动染色机，德国Leica公司（型号：ST5010 Autostainer XL）；自动台式组织脱水机，德国Leica公司（型号：TP1020）；手动轮转式切片机，德国Leica公司（型号：RM2235）；烘片仪，德国Leica公司（型号：HI1220）；石蜡切片的水浴装置，德国Leica公司（型号： HI1210）。

1.2 造模

将处于对数生长期的CT26小鼠结肠癌细胞，用0.25%胰蛋白酶加0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）的消化液消化收集。用1×磷酸缓冲盐溶液（PBS）制成细胞浓度为1×10⁷/mL的细胞重悬液。气体麻醉后，所有BALB/c小鼠腋下用酒精棉球消毒，用1 mL注射器在右腋下皮下注射0.1 mL的肠癌细胞悬液（每只小鼠接种1×10⁶个细胞），然后轻轻退出针头，干棉球按压针孔15 s后回笼，每隔2天观察小鼠皮下成瘤情况。

1.3 分组与干预

当小鼠皮下移植瘤大小为5 mm×5 mm时，将32只小鼠采用随机数字表法分为4组，分别为模型组、奥沙利铂组、参苓白术散组、参苓白术联合奥沙利铂组，每组8只。待扪及皮下肿瘤组织后，每日用游标卡尺测定肿瘤大小；当小鼠瘤体达到100～150 mm³时，开始给药。参苓白术散组根据人的使用剂量，按照体表面积折算法进行人和小鼠等效剂量换算给予参苓白术散（15.6 g/kg），1次/d，连续灌胃18 d。奥沙利铂腹腔注射给药量实验采用最大耐受剂量（MTD）15 mg/kg的1/3进行每3天1次持续给药，共计18 d。

模型组：以质量分数为0.9%的氯化钠溶液灌胃，0.2 mL/只，1次/d；腹腔注射质量分数为0.9%的氯化钠溶液，0.2 mL/次，每3天1次。

奥沙利铂组（OXA）：质量分数为0.9%的氯化钠溶液灌胃，0.2 mL/只，1次/d；奥沙利铂腹腔注射，5 mg/kg，0.2 mL/次，每3天1次。

参苓白术散组（SLBZ）：参苓白术散灌胃，0.2 mL/只，1次/d；腹腔注射质量分数为0.9%的氯化钠溶液，0.2 mL/次，每3天1次。

参苓白术散联合奥沙利铂组（SLBZ+OXA）：参苓白术散灌胃，0.2 mL/只，1次/d；奥沙利铂腹腔注射，5 mg/kg，0.2 mL/次，每3天1次。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 小鼠一般情况、瘤质量、脾指数检测

①一般状况检查：实验期间每日测量小鼠体质量，观察小鼠精神状态和一般状况（包括小鼠被毛、进食、饮水、大小便等）及存活情况。每两日运用游标卡尺对小鼠皮下瘤进行一次脱毛后测量，通过计算瘤体体积，比较各组小鼠的瘤体生长情况。瘤体体积计算公式：瘤体积（mm³）=瘤体长径（mm）×瘤体宽径（mm）×瘤体高径（mm）×0.5。根据每两天的瘤体体积均值绘制瘤体生长情况图，观察瘤体生长速率，比较瘤体生长趋势。②连续给药18 d后称取小鼠体质量，通过眼球取血1 mL加入含1%肝素钠的离心管中，常温静置2 h，3 000 r/min、4 ℃离心15 min后获得待测血清，保存于-80 ℃冰箱中备用。③分离小鼠脾脏，用质量分数为0.9%的氯化钠溶液冲洗后擦干、称重，计算脾指数。脾指数（mg/g）=脾脏质量（mg）/小鼠体质量（g）×10。④无菌剥离瘤块，称取瘤块质量。

1.4.2 结肠组织病理观察

连续给药18 d后，每只小鼠取一段结肠，并沿肠管纵轴纵向剖开；剪取一小段结肠样品，然后置于4%多聚甲醛中固定。过夜自动脱水机脱水，石蜡包埋，切片（厚度4 μm），烤片后，利用全自动染色机器对石蜡切片进行苏木素-伊红（HE）染色法检测各组小鼠肠道组织形态学的改变情况。

1.4.3 结肠组织免疫组织化学（IHC）法观察

连续给药18 d后，按照“1.4.2”中的方法，每只小鼠取一部分结肠组织，石蜡切片常规脱蜡至水，3%H₂O₂去离子水室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS清洗；将切片浸入到EDTA修复液中进行热抗原修复，室温下自然冷却，PBS清洗；滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液37 ℃孵育30 min；滴加适当稀释的紧密连接蛋白claudin、occludin和ZO-1抗体，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃过夜，PBS冲洗；滴加生物素标记山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗；滴加链霉亲和素-生物素复合物（SABC）免疫组化染色试剂，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗；diaminobezidin 3,3-二氨基联苯胺（DAB）染色液显色5 min；苏木素复染；吹干后，树脂封片。光镜下观察各组结肠组织蛋白表达情况，利用ImageJ图像分析系统，每张切片取阳性细胞表达最强染色部位，选择5个视野，测定阳性区域图像的平均吸光度（AOD）。

1.4.4 肠道屏障功能检测

连续给药18 d后，按照“1.4.1”中的方法，每只小鼠取血清20 μL，检测小鼠二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）等肠道屏障功能的主要相关指标。根据酶联免疫吸附（ELISA）法试验试剂盒操作说明进行检测，制作标准曲线，根据吸光度（OD）计算相应的数值。取每只小鼠一段结肠组织在4 ℃环境下研磨消化，提取组织液上清20 μL作为待测组织液，通过ELISA试剂盒检测肠碱性磷酸酶（IAP）、肠黏膜分泌型免疫球蛋白A（sIgA）表达水平。

1.4.5 小鼠外周血白介素（IL）-17水平及脾脏中调节性T细胞（Treg）检测

连续给药18 d后，按照“1.4.1”中的方法，每只小鼠取血清20 μL，按照ELISA试剂盒说明检测各组小鼠血清中IL-17水平。将剥离的脾脏用手术剪剪碎，冰浴匀浆，转移至70 μm孔径的Falcon细胞筛网滤过，收集细胞悬液，再加红细胞裂解液，反应停止，离心，弃上清，重复2次，PBS缓冲液重悬，将细胞悬液通过40 μm孔径的Falcon细胞筛网，去除细胞团块，采集过滤后的细胞悬液，放置冰上，采用流式细胞仪检测脾脏中Treg细胞比例。

1.4.6 小鼠肿瘤组织中CD3⁺T、CD4⁺T及CD8⁺T细胞水平检测

连续给药18 d后，按照“1.4.1”中的方法，每只小鼠取一部分新鲜瘤体组织进行研磨及消化，放置于 4 ℃条件下，采用流式细胞术检测各组小鼠肿瘤组织中 CD3⁺T 细胞、CD4⁺T 细胞、CD8⁺T 细胞水平。

1.5 统计学方法

实验数据采用SPSS 25.0统计学软件进行处理。计量资料采用 $\bar{x}$ $\pm$ s表示，符合正态分布和满足方差齐性者，采用单因素方差分析（Oneway ANOVA）比较多组间均值差异。两组间比较采用独立样本t检验，重复测量数据比较采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。统计图采用GraphPad Prism8.0软件进行绘制。

2 结果

2.1 对小鼠一般状况的影响

各组小鼠在实验前精神状态、体质量及大便性状等均正常。造模期间，奥沙利铂组小鼠逐渐出现不同程度的懒动、被毛无光泽、消瘦及腹泻，肛周粘附稀便。参苓白术散联合奥沙利铂组小鼠较奥沙利铂组小鼠被毛及精神情况好转，模型组小鼠瘤体偏大，被毛暗淡无华。参苓白术散组小鼠的腹泻、被毛改变及消瘦情况显著减轻。

2.2 对小鼠体质量的影响

各组小鼠体质量均逐渐增加，从治疗第5天开始，模型组和参苓白术散组小鼠体质量开始增加，奥沙利铂组和参苓白术散联合奥沙利铂组小鼠体质量开始降低。与模型组比较，治疗后期第15天之后奥沙利铂组和参苓白术散联合奥沙利铂组小鼠体质量明显降低（P<0.05）。见图1。

图1 各组小鼠体质量比较

注：与模型组比较，*P<0.05；n=8， $\bar{x}$ $\pm$ s。

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2.3 对小鼠肿瘤生长的影响

与模型组比较，参苓白术散组、奥沙利铂组和参苓白术散联合奥沙利铂组瘤体体积及瘤体生长趋势均降低，其中治疗第15天开始奥沙利铂组及参苓白术散联合奥沙利铂组小鼠瘤体明显缩小，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。干预18 d后，与模型组比较，参苓白术散组、奥沙利铂组和参苓白术散联合奥沙利铂组瘤体体积均明显缩小（P<0.05），见图3。

图2 各组小鼠皮下移植瘤瘤体体积及生长趋势比较

注：与模型组比较，*P<0.05；n=8， $\bar{x}$ $\pm$ s。

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图3 各组干预18 d后小鼠皮下移植瘤瘤体体积比较

注： CON为模型组，OXA为奥沙利铂组，SLBZ为参苓白术散组，SLBZ+OXA为参苓白术散联合奥沙利铂组；与模型组比较，*P<0.05；n=8， $\bar{x}$ $\pm$ s。

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2.4 对小鼠脾指数的影响

干预18 d后，与模型组比较，参苓白术散组脾指数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，奥沙利铂组脾指数降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与奥沙利铂组比较，参苓白术散联合奥沙利铂组脾指数有上升的趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。与参苓白术散组比较，奥沙利铂组及参苓白术散联合奥沙利铂组脾指数降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

图4 各组干预18 d后小鼠脾指数比较

注： CON为模型组，OXA为奥沙利铂组，SLBZ为参苓白术散组，SLBZ+OXA为参苓白术散联合奥沙利铂组。与模型组比较，*P<0.05；与参苓白术散组比较，#P<0.05；n=8， $\bar{x}$ $\pm$ s。

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2.5 对小鼠结肠组织病理形态的影响

HE染色结果显示，模型组和参苓白术散组的结肠黏膜结构完整，绒毛排列整齐未见缺损。与模型组比较，奥沙利铂组的结肠组织绒毛排列稀疏，绒毛出现明显断裂和萎缩，伴有炎症细胞浸润、间质水肿以及杯状细胞减少。参苓白术散联合奥沙利铂组结肠黏膜中绒毛萎缩但排列整齐，未见绒毛缺损，无炎症改变。见图5。

图5 各组小鼠结肠黏膜结构（HE染色，×200）

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2.6 对小鼠肠黏膜紧密连接蛋白表达的影响

紧密连接蛋白主要表达在细胞膜及细胞质上，阳性染色为细胞膜出现棕黄色颗粒。与模型组相比，参苓白术散组小鼠结肠黏膜claudin、occludin、ZO-1 阳性染色颗粒均略有增加，但差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，奥沙利铂组小鼠结肠黏膜claudin、occludin、ZO-1 阳性染色颗粒均明显减少，且绒毛排列杂乱而稀疏，差异有统计学意义（P<0.05）。参苓白术散联合奥沙利铂组小鼠结肠黏膜上claudin、occludin、ZO-1 阳性染色颗粒虽较模型组与参苓白术散组减少，但相较奥沙利铂组则明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）。上述提示奥沙利铂化疗药物对肠道黏膜屏障具有一定的破坏作用，而参苓白术散能够在一定程度上修复化疗对肠道黏膜屏障的破坏。见图6、图7、图8、表1。

图6 各组小鼠结肠组织中闭合蛋白（claudin）表达情况（免疫组化染色，×200）

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图7 各组小鼠结肠组织中咬合蛋白（occludin）表达情况（免疫组化染色，×200）

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图8 各组小鼠结肠组织中闭锁小带蛋白-1（ZO-1）表达情况（免疫组化染色，×200）

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表1 各组小鼠肠黏膜紧密连接蛋白表达（AOD定量）比较（n=6，

$\bar{x}$

$\pm$ s）

组别	claudin	occludin	ZO-1
模型组	0.24±0.03	0.22±0.03	0.24±0.07
奥沙利铂组	0.21±0.04^*#	0.17±0.06^*#	0.14±0.05^*#
参苓白术散组	0.25±0.01^#	0.23±0.01^#	0.25±0.05^#
参苓白术散联合奥沙利铂组	0.22±0.04	0.21±0.02	0.22±0.04

注： claudin为闭合蛋白，occludin为咬合蛋白，ZO-1为闭锁小带蛋白1。与模型组比较，*P<0.05；与参苓白术散联合奥沙利铂组比较，#P<0.05。

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2.7 对小鼠肠道屏障功能的影响

与模型组比较，奥沙利铂组小鼠血清中DAO、D-LA含量升高（P<0.05），sIgA、IAP含量降低（P<0.05）；与模型组比较，参苓白术散组小鼠血清中DAO、D-LA含量降低（P<0.05），IAP含量升高（P<0.05）。与参苓白术散联合奥沙利铂组比较，奥沙利铂组小鼠血清中DAO、D-LA含量稍有升高，但差异无统计学意义（P>0.05），sIgA、IAP含量降低（P<0.05）；与参苓白术散联合奥沙利铂组比较，参苓白术散组DAO、D-LA含量降低（P<0.05），sIgA、IAP含量升高（P<0.05）。见表2。

表2 各组小鼠肠道屏障功能相关指标比较（n=6，

$\bar{x}$

$\pm$ s）

组别	DAO/（U·L^-1）	D-LA/（mmol·L^-1）	sIgA/（mg·L^-1）	IAP/（U·mL^-1）
模型组	7.24±0.18	3.87±0.19	17.72±0.63	94.19±4.57
奥沙利铂组	8.99±1.50^*	5.92±0.28^*	12.93±0.89^*#	71.87±9.49^*#
参苓白术散组	6.08±0.43^*#	1.73±0.27^*#	17.91±1.30^#	112.40±1.73^*#
参苓白术散联合奥沙利铂组	8.50±1.13^*	5.47±0.13^*	16.22±0.92^*	87.98±4.02^*

注： DAO为二胺氧化酶，D-LA为D-乳酸，sIgA为分泌型免疫球蛋白A，IAP为碱性磷酸酶；与模型组比较，*P<0.05；与参苓白术散联合奥沙利铂组比较，#P<0.05。

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2.8 对小鼠免疫功能的影响

与模型组比较，奥沙利铂组、参苓白术散组、参苓白术散联合奥沙利铂组小鼠血清中IL-17含量及Treg细胞水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与参苓白术散联合奥沙利铂组比较，奥沙利铂组和参苓白术散组的 IL-17含量及Treg细胞水平显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）。见图9、图10。

图9 各组小鼠外周血IL-17含量比较

注： IL-17为白介素-17。CON为模型组，OXA为奥沙利铂组，SLBZ为参苓白术散组，SLBZ+OXA为参苓白术散联合奥沙利铂组；与模型组比较，*P<0.05；与参苓白术散联合奥沙利铂组比较，#P<0.05；n=8， $\bar{x}$ $\pm$ s。

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图10 各组小鼠脾脏中Treg细胞水平比较

注： Treg为调节性T细胞。

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2.9 对小鼠肿瘤组织免疫微环境的影响

与模型组比较，奥沙利铂组、参苓白术散组及参苓白术散联合奥沙利铂组CD3⁺ T 、CD8⁺ T细胞水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与参苓白术散联合奥沙利铂组比较，奥沙利铂组和参苓白术散组CD3⁺ T细胞水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图11。

图11 各组小鼠肿瘤组织中免疫细胞水平比较

注： CD3⁺T cells为表达CD3分子的T细胞；CD8T cells为表达CD8的T细胞。

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3 讨论

近年来，随着对肠道屏障功能研究的深入，化疗时消化道不良反应不再仅限于对恶心、呕吐、腹泻的研究，而是更多倾向于通过组织结构、微生态系统、黏膜免疫、细胞凋亡、细胞因子等方面来研究化疗时肠道屏障的损伤情况。当肠黏膜细胞受损、黏膜屏障结构被破坏时，肠上皮释放大量的DAO进入血液，或随坏死脱落的肠黏膜细胞进入肠腔，导致肠上皮细胞活性增加。研究^［

7］显示，肠道黏膜屏障结构的破坏会使血浆和肠腔中的DAO上升，而肠黏膜中 DAO 的活性降低。D-LA是细菌发酵的代谢产物，肠道多种细菌均可产生，生理状态下血中D-LA主要来源于肠道，且水平较低。当肠道屏障功能受损时，肠道中大量的D-LA可通过受损的肠黏膜进入血液循环系统，使血浆D-LA水平升高。因此，监测血浆中D-LA水平可及时了解肠黏膜损害程度和通透性变化^{［参考文献 8

百度学术

8］}。肠道黏膜免疫系统损伤一方面表现为肠道正常生理结构发生变化，另一方面与之相关的免疫因子的含量（如sIgA）也会出现相应的减少^{［参考文献 9-10

9-10］}。通过检测单位质量小肠黏膜的sIgA含量，比较sIgA分泌量的变化，可显示肠道免疫屏障功能的改变。sIgA是肠黏膜的主要免疫球蛋白，为维持肠道黏膜稳态的第一道防线^{［参考文献 11

百度学术

11］}，对肠道内的共生菌及入侵病原体具有抵御作用。当肠黏膜受损时，通过干扰病原体与上皮细胞受体结合，阻止病原体附着于宿主细胞，影响病原菌毒力及免疫排异，从而阻止病原体的传播和进一步的感染^{［参考文献 12-13

12-13］}。IAP在维持肠黏膜屏障的稳定、调控肠道营养物质的吸收和肠道功能稳定方面起着重要的作用^{［参考文献 14

百度学术

14］}。本研究结果显示，化疗药物会导致小鼠肠道黏膜屏障在一定程度上受损，肠道黏膜屏障受损会导致肠道免疫功能低下，引起肠道菌群失调，同时消化吸收发生障碍，导致肠道炎症的发生率增加。完整良好的肠黏膜屏障对肠道菌群稳态以及抑制肠道炎症具有重要作用。本实验中奥沙利铂组小鼠肠道内sIgA以及IAP含量下降，血清中DAO和D-LA含量上升，而参苓白术散组小鼠肠道内环境的sIgA以及IAP水平上升。上述结果提示化疗会导致肠道黏膜免疫系统受损，而参苓白术散在一定程度上可以作用于肠黏膜细胞改善肠道黏膜屏障结构和肠道免疫内环境，从而缓解化疗药物带来的肠道损伤以及通透性的变化，进而对肠道免疫屏障起到一定的保护作用。

Th17和IL-17水平被证明与结直肠癌的预后相关^［

15］。在肠道免疫屏障中，Th17和Treg的平衡是胃肠道内外环境的一个关键屏障^{［参考文献 16-17

16-17］}，IL-17信号通路可增加Treg的免疫抑制活性，从而导致肿瘤的生长和发展。这种新的机制通过IL-17信号通路对适应性免疫系统产生作用，将癌症期间的肠道炎症作为肿瘤控制的屏障^{［参考文献 18

百度学术

18］}。

机体的免疫功能对恶性肿瘤的发生发展起着至关重要的作用^［

19］，其中CD8⁺T细胞在肿瘤免疫中起着核心作用。肿瘤微环境中T淋巴细胞以CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞为主，其中CD8⁺T细胞的浸润减少或功能受损，会导致许多癌症疗法的临床预后较差^{［参考文献 20

百度学术

20］}。Treg细胞是CD4⁺T细胞的一个亚群，Treg细胞不仅在自身免疫调节反应中起作用，且在肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。其过量表达在炎症时可预防自身过度免疫反应造成的自身组织损伤，而在肿瘤形成的过程中则抑制机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，导致肿瘤免疫逃逸^{［参考文献 21-22

21-22］}。

本研究发现，参苓白术散可以促进肿瘤组织中CD8⁺T细胞浸润增加，奥沙利铂同样可以使CD8⁺T细胞浸润增加，两者联合用药，可以使小鼠肿瘤微环境中CD8⁺T细胞的浸润明显增加，从而起到抑制肿瘤生长、改善肿瘤免疫微环境的作用。诸多研究表明，中药具有调节机体免疫的作用。参苓白术散始载于《太平惠民和剂局方》，功效主要为益气健脾、化湿止泻，方中党参、茯苓、白术等均能提高机体的免疫功能。研究^［

23］发现，党参多糖可以增强机体免疫应答，并具有免疫促进作用。茯苓水提物可以增加脾脏NK、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞比例及增强NK细胞的活性，进而发挥免疫调控作用^{［参考文献 24

百度学术

24］}。白术多糖可通过抑制相关信号通路活化，改善重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜免疫屏障损伤^{［参考文献 25

百度学术

25］}。有研究^{［参考文献 26

百度学术

26］}发现，扶正类中药中最常用的组合党参、茯苓、白术寒温并用、肝脾同调，可有效调节IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β1（TGF-β1）等细胞因子水平，具有抑制肿瘤生长、延缓肿瘤发展的作用。

本研究结果显示，与奥沙利铂组的单纯化疗相比，参苓白术散联合奥沙利铂化疗可以抑制大肠癌小鼠皮下移植瘤的瘤体生长，改善荷瘤小鼠肠道黏膜屏障结构和肠道免疫内环境的的指标，提高肿瘤组织中CD8⁺T细胞，改善肿瘤免疫微环境，进而抑制肿瘤细胞的转移生长。本研究结果提示，参苓白术散可在一定程度上修复奥沙利铂化疗后引起的肠道黏膜屏障损伤，但其具体的作用机制仍待进一步深入研究。

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摘要

目的,2,观察参苓白术散对大肠癌移植瘤模型小鼠化学疗法（简称“化疗”）后肠道黏膜屏障的作用效果。,方法,2,将32只SPF级BALB/c小鼠皮下接种CT26肠癌细胞，成瘤后随机分为模型组、奥沙利铂组、参苓白术散组、参苓白术散联合奥沙利铂组，每组8只。模型组予蒸馏水灌胃（0.2 mL/次，1次/d），奥沙利铂组予奥沙利铂5 mg/kg腹腔注射（0.2 mL/次，每3天1次），参苓白术散组15.6 g/kg灌胃（0.2 mL/次，1次/d），参苓白术散联合奥沙利铂组予参苓白术散15.6 g/kg灌胃（0.2 mL/次，1次/d）联合奥沙利铂5 mg/kg腹腔注射（0.2 mL/次，每3天1次），共治疗18 d。治疗结束后每组选取8只小鼠采集血清，以酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）、白介素-17（IL-17）以及肠道黏膜中肠碱性磷酸酶（IAP）、肠黏膜分泌型免疫球蛋白A（sIgA）；剥取小鼠瘤体、脾脏并称重，通过苏木素-伊红（HE）染色法和免疫组织化学（IHC）染色法在组织形态学上分析参苓白术散对小鼠肠道黏膜的影响，并通过流式细胞术检测肿瘤组织中免疫微环境的变化情况。,结果,2,与模型组比较，参苓白术散组、奥沙利铂组以及参苓白术散联合奥沙利铂组均能抑制肿瘤的生长，其中参苓白术散联合奥沙利铂能显著抑制肿瘤的生长（,P,<,0.05）；奥沙利铂单独治疗能显著降低肠IAP的表达（,P,<,0.05），同时可以显著升高D-LA（,P,<,0.05）和DAO的表达水平（,P,<,0.05）。HE染色结果表明，参苓白术散可以显著修复化疗之后结肠绒毛的组织学排列，并且减少炎症反应发生。IHC染色结果表明，参苓白术散能显著提高化疗后小鼠结肠紧密连接蛋白闭合蛋白（claudin）、咬合蛋白（occludin）和闭锁小带蛋白-1（ZO-1）的表达水平。和奥沙利铂相比，参苓白术散联合奥沙利铂能缓解肠道黏膜的屏障损伤，一定程度修复化疗引起的肠道黏膜屏障损伤。另一方面，参苓白术散能增加肿瘤微环境中CD8,+,T细胞的浸润。,结论,2,参苓白术散能够保护化疗后肠黏膜屏障，改善肿瘤免疫微环境，从而抑制小鼠皮下移植瘤的生长。

Abstract

Objective,2,To observe the effect of Shenling Baizhu Powder （SLBZ） on intestinal mucosal barrier in mice with xenograft model of colorectal cancer after chemotherapy.,Methods,2,Thirty-two SPF grade BALB/c mice were subcutaneously inoculated with CT26 colorectal carcinoma cells， and after tumor formation they were randomly divided into four groups （,n,=8 each）： model group， oxaliplatin group， SLBZ group， and SLBZ plus oxaliplatin group. Mice in the model group were given distilled water by gavage （0.2 mL， once daily）， mice in the oxaliplatin group were treated with intraperitoneal injection of 5 mg/kg oxaliplatin （0.2 mL， once every 3 days）， mice in the SLBZ group were treated with 15.6 g/kg SLBZ by gavage （0.2 mL， once daily）， and mice in the SLBZ plus oxaliplatin group were treated with 15.6 g/kg SLBZ by gavage （0.2 mL， once daily） and intraperitoneal injection of 5 mg/kg oxaliplatin （0.2 mL， once every 3 days）. The treatment lasted for 18 days. At the end of treatment，8 mice in each group were selected for serum collection， and the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect serum diamine oxidase （DAO）， D-lactic acid （D-LA）， interleukin-17 （IL-17）， intestinal alkaline phosphatase （IAP） and intestinal mucosal secretory immunoglobulin A （sIgA）. The tumors and spleens of the mice were excised and weighed. Hematoxylin and Eosin （HE） staining and Immunohistochemistry （IHC） staining were used to analyze the effect of SLBZ on intestinal mucosa of mice in histomorphology， and flow cytometry was used to detect the changes of immune microenvironment in tumor tissues.,Results,2,Compared with the tumor growth condition in the model group， the tumor growth was inhibited in SLBZ group and oxaliplatin group， and significantly inhibited in SLBZ plus oxaliplatin group （,P,<,0.05）. Oxaliplatin treatment alone significantly decreased the expression of IAP （,P,<,0.05）， and significantly increased the expression of D-LA （,P,<,0.05） and DAO （,P,<,0.05）. The results of HE staining showed that SLBZ could significantly repair the histological arrangement of colonic villi after chemotherapy and reduce the occurrence of inflammatory reactions. The results of IHC staining showed that SLBZ could significantly increase the expression of colonic tight junction proteins （claudin）， occludin and zonula occludens-1 （ZO-1） in colon of mice after chemotherapy. Compared with the effect of oxaliplatin treatment alone， SLBZ plus oxaliplatin could alleviate the intestinal mucosa barrier damage， and repair the chemotherapy-induced intestinal mucosal barrier damage to a certain extent. Meanwhile， SLBZ could increase the CD8,+, T cell infiltration in the tumor microenvironment.,Conclusion,2,SLBZ can protect the intestinal mucosal barrier after chemotherapy and improve the tumor immune microenvironment， thereby inhibiting the growth of subcutaneously xenograft tumors in mice.

关键词

大肠癌经典名方肠道黏膜屏障肿瘤微环境化学疗法模型小鼠中药研究

Keywords

colorectal cancerChinese classic formulasintestinal mucosal barriertumor microenvironmentchemotherapymouse modeltraditional Chinese herbal medicine research

references

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