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基于FOXO1的抗氧化作用探讨六味地黄方对去卵巢大鼠及H2O2诱导的氧化损伤MC3T3⁃E1细胞的干预作用
创新中药与经典名方专栏 | 更新时间:2023-07-15
    • 基于FOXO1的抗氧化作用探讨六味地黄方对去卵巢大鼠及H2O2诱导的氧化损伤MC3T3⁃E1细胞的干预作用

    • Intervention effect of Liuwei Dihuang Decoction on ovariectomized rats and H2O2⁃induced oxidative damaged MC3T3⁃E1 cells based on antioxidant effect of FOXO1

    • 陶乐维

      ,  

      韩煦

      ,  

      陈清光

      ,  

      徐隽斐

      ,  

      陆灏

      ,  
    • 上海中医药杂志   2023年57卷第7期 页码:13-20
    • DOI:10.16305/j.1007-1334.2023.2203059    

      中图分类号:

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  • 陶乐维,韩煦,陈清光,等.基于FOXO1的抗氧化作用探讨六味地黄方对去卵巢大鼠及H2O2诱导的氧化损伤MC3T3⁃E1细胞的干预作用[J].上海中医药杂志,2023,57(7):13-20. DOI: 10.16305/j.1007-1334.2023.2203059.

    TAO Lewei,HAN Xu,CHEN Qingguang,et al.Intervention effect of Liuwei Dihuang Decoction on ovariectomized rats and H2O2⁃induced oxidative damaged MC3T3⁃E1 cells based on antioxidant effect of FOXO1[J].Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine,2023,57(7):13-20. DOI: 10.16305/j.1007-1334.2023.2203059.

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    摘要

    目的

    观察六味地黄方对去卵巢(OVX)大鼠氧化应激相关指标、骨转换标志物及股骨叉头框蛋白O1(FOXO1)表达的干预作用,并探讨其能否通过FOXO1来发挥抗氧化作用及其作用机制。

    方法

    (1)动物实验。将雌性Wistar大鼠分为正常组、假手术组、模型组、补佳乐组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)组、六味地黄方大剂量及小剂量组,药物干预8周后检测骨髓活性氧(ROS)、血清抗氧化指标[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、还原型谷胱甘肽(GSH)]、骨转换标志物[骨碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(OCN)、血清I型胶原羧基末端肽(CTX-I)]及股骨FOXO1蛋白表达。(2)细胞实验。制备对照组含药血清和低、中、高剂量含药血清。①将胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)分为正常组、模型组、对照含药血清组,以及低、中、高剂量含药血清组和NAC组,检测各组细胞FOXO1蛋白表达。②沉默MC3T3-E1细胞的FOXO1基因表达,以Western blot法验证后,将细胞分为正常组、模型组、NAC组、高剂量含药血清组、siNC组、siFOXO1组、siFOXO1+高剂量含药血清组,检测各组细胞的增殖及ROS水平。③将MC3T3-E1细胞分为正常组、模型组、NAC组、对照含药血清组,以及高剂量含药血清组,检测各组细胞p-FOXO1蛋白表达。

    结果

    (1)动物实验:与假手术组比较,模型组SOD、CAT、GSH-PX、GSH、BALP、OCN水平均明显降低(P<0.05),CTX-I、ROS水平及FOXO1蛋白表达均明显升高(P<0.05);与模型组比较,六味地黄方大剂量组SOD、CAT、GSH-PX、GSH、BALP、OCN水平均明显升高(P<0.05),CTX-I、ROS水平及FOXO1蛋白表达均明显降低(P<0.05)。(2)细胞实验:①与正常组比较,经H2O2处理的MC3T3-E1细胞FOXO1蛋白表达明显增加(P<0.05);含药血清各剂量组FOXO1蛋白表达均低于模型组(P<0.05);②沉默MC3T3-E1细胞FOXO1基因后,siFOXO1组在48 h及72 h细胞增殖均明显低于模型组和siNC组(P<0.05),ROS水平明显高于模型组和siNC组(P<0.05);siFOXO1+高剂量含药血清组在各时间点细胞增殖均明显高于模型组和siFOXO1组(P<0.05),但都明显低于高剂量含药血清组(P<0.05);ROS水平明显低于模型组和siFOXO1组(P<0.05),但明显高于高剂量含药血清组(P<0.05);③通过检测p-FOXO1发现,模型组p-FOXO1/GAPDH明显低于正常组(P<0.05);高剂量含药血清组p-FOXO1/GAPDH明显高于模型组(P<0.05)。

    结论

    六味地黄方能抑制OVX大鼠骨髓ROS水平,提高血清抗氧化水平,促进OVX大鼠骨形成,抑制骨吸收,其机制可能部分与促进成骨细胞FOXO1磷酸化有关。

    Abstract

    Objective

    To observe the intervention effect of Liuwei Dihuang Decoction on oxidative stress-related indices, bone turnover markers and the protein expression of FOXO1 in femoral in ovariectomized (OVX) rats. And to explore whether Liuwei Dihuang Decoction can exert antioxidant effect through FOXO1 and its mechanism.

    Methods

    (1) In animal experiment: Female Wistar rats were divided into normal group, sham-operated group, model group, Progynova group, N-acetylcysteine (NAC) group, Liuwei Dihuang Decoction high- and low-dose groups. Reactive oxygen species of bone marrow, serum antioxidant indices including SOD, CAT, GSH-PX, GSH and bone turnover markers including BALP, OCN, CTX-I, and the protein expression of FOXO1 in femoral were detected after 8 weeks of intervention. (2) In cell experiments, the decoction of Liuwei Dihuang was prepared and then the medicated serum of Liuwei Dihuang Decoction was collected, including medicated serum of control group, medicated serum groups with low-, medium-and high-dose. ①MC3T3-E1 cells were divided into normal group, model group, control medicated serum group, low-, medium- and high-dose medicated serum group of Liuwei Dihuang Decoction and NAC group. Protein expression of FOXO1 in each group was detected to verify the results of animal experiment. ②FOXO1 gene expression of MC3T3-E1 cells was silenced. After verified by Western blot, the cells were divided into normal group, model group, NAC group, high-dose medicated serum group of Liuwei Dihuang Decoction, siNC group, siFOXO1 group, and siFOXO1+ high-dose group of Liuwei Dihuang Decoction medicated serum. The proliferation and ROS levels of cells in each group were detected. ③MC3T3-E1 cells were divided into normal group, model group, NAC group, control medicated serum group and high-dose medicated serum group of Liuwei Dihuang Decoction, and the protein expression of p-FOXO1 in each group was detected.

    Results

    (1) In animal experiment: Compared with the sham operation group, SOD, CAT, GSH-PX, GSH, BALP and OCN levels were significantly decreased (P<0.05), while CTX-I, ROS levels and FOXO1 protein expression were significantly increased in the model group (P<0.05). Compared with the model group, SOD, CAT, GSH-PX, GSH, BALP and OCN levels in high-dose group of Liuwei Dihuang Decoction were significantly increased (P<0.05), while CTX-I, ROS levels and FOXO1 protein expression were significantly decreased (P<0.05). (2) In cell experiment: ①Compared with the normal group, the protein expression of FOXO1 in MC3T3-E1 cells treated with H2O2 was significantly increased (P<0.05). The protein expression of FOXO1 in each dose group of medicated serum of Liuwei Dihuang Decoction was lower than that in the model group (P<0.05). ②After silencing the FOXO1 gene in MC3T3-E1 cells, the cell proliferation in the siFOXO1 group at 48 h and 72 h was significantly lower than that in the model group and siNC group (P<0.05), and the level of ROS was significantly higher than that in the model group and siNC group (P<0.05). The cell proliferation in the siFOXO1+high-dose medicated serum of Liuwei Dihuang Decoction was significantly higher than that in the model group and siFOXO1 group at each time point (P<0.05), but significantly lower than that in the high-dose group of medicated serum of Liuwei Dihuang Decoction (P<0.05); the level of ROS was significantly lower than that in the model group and siFOXO1 group (P<0.05), but significantly higher than that in the high-dose group of medicated serum of Liuwei Dihuang Decoction (P<0.05). ③p-FOXO1/GAPDH in the model group was significantly lower than that in the normal group (P<0.05), and p-FOXO1/GAPDH in the high-dose group of medicated serum of Liuwei Dihuang Decoction was significantly higher than that in the model group (P<0.05).

    Conclusion

    Liuwei Dihuang Decoction can inhibit ROS levels in bone marrow of OVX rats, increase antioxidant levels in serum, promote bone formation and inhibit bone resorption in OVX rats. The mechanism may be partly related to promoting the phosphorylation of FOXO1 in osteoblasts.

    近年来发现,成骨细胞叉头框蛋白O(FOXO)家族的抗氧化作用对于维持骨骼的稳态、改善氧化应激具有重要作用

    1-2,FOXO1是其中非常重要并发挥关键作用的一个转录因子3-4。在前期研究5-6中,我们发现六味地黄方含药血清能改善过氧化氢(H2O2)对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)造成的氧化损伤,促进其增殖分化,升高还原型谷胱甘肽(GSH)水平,降低细胞内活性氧(ROS)水平,但六味地黄方是否通过FOXO1来发挥以上作用目前并不清楚。因此,本研究采用六味地黄方干预去卵巢(OVX)大鼠,观察其对骨髓ROS水平、血清抗氧化指标、骨转换标志物及股骨FOXO1蛋白表达的影响,并进一步通过细胞实验探讨六味地黄方能否通过影响FOXO1来发挥抗氧化作用及其作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 动物

    Wistar雄性大鼠40只、雌性大鼠42只,体质量200 g左右,SPF级,购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。动物使用许可证号:SYXK(沪)2020-0009。动物生产许可证号:SCXK(沪)2018-0006。大鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心。动物饲养条件:湿度(55±10)%,温度(23±2)℃,昼夜交替光照与黑暗12 h︰12 h,自由进食进水。实验过程中所有操作均符合上海中医药大学实验动物伦理委员会规定(伦理批准号:PZSHUTCM190912002)。

    1.1.2 细胞

    MC3T3-E1,购自中国科学院上海细胞库。

    1.1.3 药物与试剂

    六味地黄方药物组成、产地及煎煮方法参见文献

    5

    戊酸雌二醇片(补佳乐),法国DELPHARM Lille S.A.S.公司(批号:488A);H2O2,上海阿拉丁生化科技股份有限公司(批号:H112515);N-乙酰半胱氨酸(NAC),瑞阳制药有限公司(批号:19050303);替来他明/唑拉西泮(舒泰50),法国维克有限公司(批号:83887901);ROS检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司(批号:S0033);还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒(批号:A006-2)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)(批号:A005)、超氧化物歧化酶(SOD)(批号:A001-3)、过氧化氢酶(CAT)(批号:A007-2)、蛋白定量试剂盒(批号:A045-3),南京建成生物工程研究所;I型胶原羧基末端肽(CTX-I)(批号:XY-E30026)、骨钙素(OCN)(批号:XY-E30604)、骨碱性磷酸酶(BALP)试剂盒(批号:XY-E30037),上海信裕生物有限公司;CCK-8试剂盒,美国Sab公司(批号:CP002);0.25%胰蛋白酶(批号:T1300-100)、青霉素-链霉素混合液(批号:P1400-100),北京索莱宝科技有限公司;胎牛血清,美国Gibco公司(批号:16000-044);α基础培养基(α-MEM),美国HyClone公司(批号:SH30265.01);FOXO1(批号:Bs-23175R)、p-FOXO1一抗(批号:Bs-13207R),北京博奥森生物技术有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔,上海碧云天生物技术有限公司(批号:A0208);甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),美国 Cell Signaling Technology 公司(批号:5174)。

    1.1.4 主要仪器

    电转仪,大连竞迈科技有限公司(型号:PS-9);恒温水浴箱,北京市长凤仪器仪表公司(型号:HW-SY11-K);CO2恒温培养箱,美国Thermo Fisher Scientific公司(型号:3111);生物安全柜,苏州金净净化设备公司(型号:BHC-1300IIB2);流式细胞仪,美国Beckman公司(型号:CytoFLEX);酶标仪,美国BioTek公司(型号:Synergy H1);离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司(型号:TDZ4-WS);电泳仪,美国Bio-Rad公司(型号:mini protean 3 cell);0.22 µm过滤器,美国Millipore公司(型号:SLGP033RB);成像系统,上海天能公司(型号:5200);超低温冰箱,美国Thermo Fisher Scientific公司(型号:900系列)。

    1.2 动物实验

    1.2.1 分组与造模

    将42只Wistar雌性大鼠分为正常组、假手术组、模型组、补佳乐组、NAC组,以及六味地黄方大剂量组及小剂量组,每组6只。除正常组外,其他大鼠用舒泰50按照40 mg·kg-1体质量腹腔注射麻醉,肌内注射0.2 mL的阿托品。麻醉后,参照文献

    7方法,假手术组大鼠切除两侧卵巢下方的部分脂肪组织后缝合,其他大鼠均切除两侧卵巢。术后3 d,每日1次肌内注射青霉素8万U。术后1周行阴道脱落细胞涂片检查,确认手术成功。

    1.2.2 干预

    给药周期为8周。假手术组和模型组均给予质量分数为0.9%的氯化钠溶液灌胃;按照成人每日用药量换算,六味地黄方小剂量组予7.5 g·kg-1·d-1六味地黄方灌胃,六味地黄方大剂量组予15 g·kg-1·d-1六味地黄方灌胃;补佳乐组给予0.1 mg·kg-1·d-1补佳乐灌胃。以上各组均每日灌胃1次。NAC组给予NAC,剂量为50 mg·kg-1·d-1,每天1次,皮下注射。

    1.2.3 检测指标与方法

    (1)大鼠氧化应激及骨转换标志物。取股骨骨髓,采用二氯荧光黄二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测ROS水平。按照试剂盒说明书检测血清中抗氧化指标,包括SOD活力以及CAT、GSHPX、GSH含量。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测骨转换标志物,包括骨形成标志物BALP、OCN,骨吸收标志物CTX-I。

    (2)大鼠股骨FOXO1蛋白表达。采用Western blot法检测大鼠股骨中的FOXO1蛋白表达。取大鼠股骨,加入细胞裂解液(RIPA),冰上裂解30 min后,离心收集上清提取细胞蛋白。二辛可宁酸(BCA)法测定细胞总蛋白浓度。各孔取25 µg的蛋白上样,于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离(浓缩胶80 V电压,20 min;分离胶120 V电压,60 min)。将分离后的蛋白电转移(100 mA电流,90 min)至聚偏二氟乙烯(PVDF膜)。加入5%脱脂奶粉封闭液于摇床上室温封闭1 h。用等渗缓冲盐溶液(TBST)洗膜3次,每次5 min,分别加入一抗抗体(体积稀释比例均为1∶1 000)4 ℃反应过夜。次日先以TBST洗膜3次,每次5 min。后加入HRP标记的抗兔IgG(体积稀释比例为1∶1 000),室温反应1 h。再用TBST洗膜3次,每次5 min。按增强化学发光(ECL)试剂盒说明进行显影。采用ImageJ 软件对蛋白条带进行灰度分析。

    1.3 细胞实验

    1.3.1 含药血清的制备

    40只雄性Wistar大鼠随机分为4组,即对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组10只,分别灌胃给予质量分数为0.9%的氯化钠溶液、低剂量六味地黄方(15 g·kg-1·d-1)、中剂量六味地黄方(30 g·kg-1·d-1)和高剂量六味地黄方(45 g·kg-1·d-1)。按每100 g大鼠体质量1 mL给药,连续灌胃5 d,于第5天灌胃1 h后腹主动脉取血后处死。将装有大鼠血液的离心管离心,取同组血清合并,制备对照组含药血清和低、中、高剂量组含药血清,并于56 ℃水浴箱灭活30 min。将灭活后的血清通过0.22 μm Millipore过滤器过滤,分装后放入-80 ℃冰箱保存备用。

    1.3.2 MC3T3-E1细胞培养

    MC3T3-E1细胞复苏后,用含10%的胎牛血清、含青霉素-链霉素混合液的α-MEM培养液,于37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。细胞隔天换液,当生长至70%~80%融合时,用胰酶消化传代。取对数生长期细胞用于本实验。

    1.3.3 细胞分组

    ①FOXO1蛋白表达:实验分为正常组、模型组、对照含药血清组,以及低、中、高剂量含药血清组、NAC组。②细胞转染及验证:分为正常组、FOXO1小干扰RNA转染组(siFOXO1组)、阴性对照小干扰RNA转染组(siNC组)。③沉默FOXO1基因后含药血清对细胞增殖及ROS水平干预作用:分为正常组、模型组、NAC组、高剂量含药血清组、siNC组、siFOXO1组、siFOXO1+高剂量含药血清组。④含药血清对p-FOXO1表达的干预作用:分为正常组、模型组、NAC组、对照含药血清组、高剂量含药血清组。

    1.3.4 细胞药物干预

    除正常组外,其余各组先用1.0 mmol·L-1的H2O2预处理MC3T3-E1细胞6 h,随后模型组、siNC组、siFOXO1组更换正常培养基,NAC组更换含2.5 mmol·L-1 NAC的培养基,对照含药血清组和高、中、低剂量含药血清组均更换为相应组别含10%大鼠血清的培养基。各组均处理24 h。

    1.3.5 检测指标及方法

    (1)FOXO1蛋白表达。参照“1.3.4”项下方法进行药物干预。FOXO1蛋白检测:将需要抽提蛋白的细胞从培养箱中取出,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞后离心收集细胞沉淀,加入RIPA提取蛋白,BCA法测定细胞蛋白浓度。其余操作参照“1.2.3(2)”项下方法。

    (2)细胞转染及转染后验证。细胞转染委托上海吉玛制药技术有限公司完成。细胞转染后蛋白验证参照“1.3.5(1)”项下方法。

    (3)沉默FOXO1基因后细胞增殖及ROS水平。参照“1.3.4”项下方法处理细胞。分别于培养48 h、72 h后,加入 CCK-8并放入培养箱中孵育,于450 nm处读取光密度(OD)值。采用DCFH-DA荧光探针,检测细胞内ROS水平。

    (4)六味地黄方含药血清对p-FOXO1表达的干预作用。参照“1.3.4”项下方法处理细胞;参照“1.3.5(1)”项下方法检测FOXO1及p-FOXO1蛋白表达。

    1.4 统计学方法

    实验数据采用SPSS 18.0 软件进行统计学分析。计量资料用ˉx±s表示。组间比较采用One-way ANOVA检验,如统计有差异时再进行组间多重比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

    2 结果

    2.1 动物实验

    2.1.1 对大鼠骨髓ROS的干预作用

    与假手术组比较,模型组大鼠ROS水平升高(P<0.05)。与模型组比较,补佳乐组、NAC组以及六味地黄方大、小剂量组ROS水平均明显降低(P<0.05)。补佳乐组、NAC组、六味地黄方大剂量组的ROS水平明显低于六味地黄方小剂量组(P<0.05)。见图1

    fig

    图1  各组ROS水平比较

    注:  ROS为活性氧,NAC为N-乙酰半胱氨酸。与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与补佳乐组比较,△P<0.05;与NAC组比较,▽P<0.05;与六味地黄方大剂量组比较,▲P<0.05。n=6,ˉx±s

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    2.1.2 对大鼠血清抗氧化指标的干预作用

    与假手术组比较,模型组大鼠SOD、CAT、GSH-PX、GSH水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,补佳乐组、NAC组和六味地黄方大剂量组SOD、CAT、GSH-PX、GSH水平均明显升高(P<0.05),六味地黄方小剂量组GSH-PX明显升高(P<0.05)。与补佳乐组比较,六味地黄方大剂量组SOD水平明显降低(P<0.05),六味地黄方小剂量组SOD、CAT、GSH-PX、GSH水平均明显降低(P<0.05)。与NAC组比较,六味地黄方大剂量组SOD、GSH及六味地黄方小剂量组SOD、CAT、GSH-PX、GSH水平均明显降低(P<0.05)。与六味地黄方大剂量组比较,六味地黄方小剂量组GSH-PX水平明显降低(P<0.05)。见图2

    fig

    图2  各组抗氧化指标比较

    注:  SOD为超氧化物歧化酶,CAT为过氧化氢酶,GSH-PX为谷胱甘肽过氧化物酶,GSH为还原型谷胱甘肽,NAC为N-乙酰半胱氨酸。与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与补佳乐组比较,△P<0.05;与NAC组比较,▽P<0.05;与六味地黄方大剂量组比较,▲P<0.05。n=6,ˉx±s

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    2.1.3 对大鼠血清骨转换标志物的干预作用

    与假手术组比较,模型组BALP、OCN水平明显降低,CTX-I水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,补佳乐组、NAC组及六味地黄方大剂量组的BALP、OCN水平均明显升高(P<0.05),CTX-I水平均明显降低(P<0.05)。与补佳乐组比较,六味地黄方小剂量组BALP水平明显降低(P<0.05)。与NAC组比较,六味地黄方小剂量组BALP水平明显降低(P<0.05),六味地黄方大剂量组、小剂量组OCN水平均明显降低(P<0.05),六味地黄方小剂量组CTX-I水平明显升高(P<0.05)。与六味地黄方大剂量组比较,六味地黄方小剂量组各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。见图3

    fig

    图3  各组骨转换标志物水平比较

    注:  BALP为骨碱性磷酸酶,OCN为骨钙素,CTX-I为Ⅰ型胶原羧基末端肽,NAC为N-乙酰半胱氨酸。与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与补佳乐组比较,△P<0.05;与NAC组比较,▽P<0.05。n=6,ˉx±s

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    2.1.4 对大鼠股骨FOXO1蛋白表达的干预作用

    与假手术组比较,模型组大鼠股骨FOXO1蛋白表达明显升高(P<0.05)。与模型组比较,补佳乐组、NAC组以及六味地黄方大、小剂量组股骨FOXO1蛋白表达均明显降低(P<0.05)。与补佳乐组比较,NAC组及六味地黄方大、小剂量组股骨FOXO1蛋白表达均明显升高(P<0.05)。与NAC组比较,六味地黄方大、小剂量组股骨FOXO1蛋白表达均明显升高(P<0.05)。与六味地黄方大剂量组比较,六味地黄方小剂量组股骨FOXO1蛋白表达明显升高(P<0.05)。见图4

    fig

    图4  各组大鼠FOXO1蛋白表达比较

    注:  左图为FOXO1蛋白电泳条带图,右图为FOXO1蛋白相对表达量统计图。FOXO1为叉头框蛋白O1,GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶,NAC为N-乙酰半胱氨酸。A为正常组,B为假手术组,C为模型组,D为补佳乐组,E为NAC组,F为六味地黄方大剂量组,G为六味地黄方小剂量组。与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与补佳乐组比较,△P<0.05;与NAC组比较,▽P<0.05;与大剂量组比较,▲P<0.05。n=6,ˉx±s

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    2.2 细胞实验

    2.2.1 对MC3T3-E1细胞FOXO1蛋白表达的干预作用

    与正常组比较,模型组细胞FOXO1蛋白表达明显增加(P<0.05)。与模型组比较,低、中、高剂量含药血清组及NAC组FOXO1蛋白表达均明显降低(P<0.05),且随着六味地黄方剂量增加,蛋白表达依次降低(P<0.05)。与NAC组比较,低、中、高剂量含药血清组蛋白表达均明显增加(P<0.05)。见图5

    fig

    图5  各组MC3T3-E1细胞FOXO1蛋白表达比较

    注:  左图为FOXO1蛋白电泳条带图,右图为FOXO1蛋白相对表达量统计图。FOXO1为叉头框蛋白O1,GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶,NAC为N-乙酰半胱氨酸。A为正常组,B为模型组,C为对照含药血清组,D为低剂量含药血清组,E为中剂量含药血清组,F为高剂量含药血清组,G为NAC组。与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与对照含药血清组比较,△P<0.05;与低剂量含药血清组比较,▽P<0.05;与中剂量含药血清组比较,▲P<0.05;与高剂量含药血清组比较,▼P<0.05。n=3,ˉx±s

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    2.2.2 沉默FOXO1基因后的验证

    沉默FOXO1基因后通过蛋白质印迹法可以发现,siFOXO1组FOXO1蛋白表达明显低于正常组及siNC组(P<0.05)。见图6

    fig

    图6  相关基因沉默后各组FOXO1蛋白表达比较

    注:  左图为FOXO1蛋白电泳条带图,右图为FOXO1蛋白相对表达量统计图。FOXO1为叉头框蛋白O1,GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。A为正常组,B为siNC组,C为siFOXO1组。 siNC组为阴性对照组,siFOXO1组为FOXO1转染组。与正常组比较,*P<0.05;与siNC组比较,#P<0.05。n=3,ˉx±s

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    2.2.3 对沉默FOXO1基因后细胞增殖的干预作用

    与模型组比较,siNC组细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)。沉默FOXO1基因后,siFOXO1组在48 h及72 h细胞增殖均明显低于模型组和siNC组(P<0.05)。经含药血清干预后,siFOXO1+高剂量含药血清组在48 h及72 h细胞增殖均明显高于模型组和siFOXO1组(P<0.05),但都明显低于高剂量含药血清组(P<0.05)。见图7

    fig

    图7  相关基因沉默后各组细胞增殖情况比较

    注:  OD为光密度,NAC为N-乙酰半胱氨酸,siNC组为阴性对照组,siFOXO1组为FOXO1转染组。与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与NAC组比较,△P<0.05;与高剂量含药血清组比较,▽P<0.05;与siNC组比较,▲P<0.05;与siFOXO1组比较,▼P<0.05。n=3,ˉx±s

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    2.2.4 对沉默FOXO1基因后ROS水平的干预作用

    与模型组比较,siNC组ROS水平差异无统计学意义(P>0.05)。沉默FOXO1基因后,siFOXO1组ROS水平明显高于模型组和siNC组(P<0.05)。经含药血清干预后,siFOXO1+高剂量含药血清组ROS水平明显低于模型组和siFOXO1组(P<0.05),但明显高于高剂量含药血清组(P<0.05)。见图8

    fig

    图8  相关基因沉默后各组ROS水平比较

    注:  ROS为活性氧,NAC为N-乙酰半胱氨酸,siNC组为阴性对照组,siFOXO1组为FOXO1转染组。与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与高剂量含药血清组比较,▽P<0.05;与siNC组比较,▲P<0.05;与siFOXO1组比较,▼P<0.05。n=3,ˉx±s

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    2.2.5 对p-FOXO1蛋白表达的干预作用

    FOXO1蛋白表达结果与“2.2.1”中的结果一致。但模型组p-FOXO1蛋白表达明显低于正常组(P<0.05),NAC组及高剂量含药血清组p-FOXO1/GAPDH均明显高于模型组(P<0.05)。高剂量含药血清组p-FOXO1蛋白表达明显低于NAC组(P<0.05)。见图9

    fig

    图9  各组FOXO1/GAPDH、p⁃FOXO1/GAPDH水平比较

    注:  左图为FOXO1、p-FOXO1蛋白电泳条带图,中图为FOXO1蛋白相对表达量统计图,右图为p-FOXO1蛋白相对表达量统计图。FOXO1为叉头框蛋白O1,p-FOXO1为磷酸化叉头框蛋白O1,GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。A为正常组,B为模型组,C为NAC组,D为对照含药血清组,E为高剂量含药血清组。与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与NAC组比较,△P<0.05;与对照含药血清组比较,▽P<0.05。n=3,ˉx±s

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    3 讨论

    随着年龄增加和性激素水平的衰退,骨骼内的ROS水平会不断增加,进而导致骨吸收增加、骨形成减少,骨重建稳态的改变导致了骨质疏松的发生

    8。中医药治疗骨质疏松症,基于“肾主骨”理论,“从肾治骨”是其重要治则。近年来,经典名方六味地黄丸(六味地黄方)用于治疗绝经后骨质疏松症,不仅可以缓解症状、改善骨密度,在作用机制方面也有很多新的发现9-10。同时也有大量文献11-14报道六味地黄方在机体多个组织和器官中具有抗氧化的作用。在前期研究中,我们发现六味地黄方含药血清能改善氧化损伤MC3T3-E1细胞的ROS水平。本研究采用的OVX大鼠不仅是经典的骨质疏松症模型15,同时也被证实其骨骼内的ROS水平明显升高16。本研究发现,六味地黄方各剂量组干预措施均能降低OVX大鼠ROS水平,其中尤以大剂量组更为显著,与此相应的是六味地黄方大剂量组干预措施能显著提高血清中抗氧化指标(SOD、CAT、GSH-PX、GSH)的含量,同时其能明显升高OVX大鼠的BALP和OCN,降低CTX-I,提示六味地黄方能促进骨形成,抑制骨吸收。

    FOXO家族最初引起人们的关注是由于发现它们具有延长线虫和果蝇寿命的作用

    17-18。随后大量研究419-20发现,FOXO家族尤其是FOXO1、FOXO3、FOXO4这3个转录因子在调控包括成骨细胞在内的氧化应激中发挥了重要作用。在既往的研究21中,我们发现六味地黄方含药血清能促进MC3T3-E1细胞FOXO1 mRNA表达。为进一步明确六味地黄方的抗氧化机制,我们将着眼点聚焦于FOXO1基因。但比较意外的是在动物实验中,我们发现六味地黄方各剂量组FOXO1蛋白表达都要低于模型组,同时大剂量组的FOXO1蛋白表达要明显低于小剂量组(P<0.05),在后续用氧化损伤MC3T3-E1细胞的验证实验中也得到了类似的结果。为此,我们尝试进一步沉默FOXO1基因表达来观察其中的变化。

    有研究

    4显示,敲除小鼠成骨细胞FOXO1基因后,骨骼中ROS水平上升,成骨细胞的数量明显减少,成骨细胞的增殖受到抑制。在我们的实验中,同样发现siFOXO1组在48 h及72 h细胞增殖均明显低于模型组和siNC组(P<0.05),ROS水平明显高于模型组和siNC组(P<0.05)。虽然siFOXO1+高剂量含药血清组在各时间点细胞增殖均明显高于模型组和siFOXO1组(P<0.05),但都明显低于高剂量含药血清组(P<0.05);类似的情况也出现在了ROS水平上。这提示沉默MC3T3-E1细胞FOXO1基因表达后还是部分影响到了六味地黄方对氧化损伤MC3T3-E1细胞增殖及对ROS的改善作用,即FOXO1对六味地黄方改善氧化应激、促进细胞增殖发挥了正向作用。那么六味地黄方又是如何通过FOXO1来发挥作用的呢?

    有研究

    1-2显示,当机体处于氧化应激状态时,蓄积的ROS能使FOXO1磷酸化,促进其转位到细胞核中,进而通过激活抗氧化基因、DNA修复基因、细胞周期基因等进一步发挥抗氧化的防御作用。同时p-FOXO1可以促进蛋白质的合成,其中就包括了GSH,其可进一步发挥改善氧化应激的作用48。在前期研究中,我们确实发现经过六味地黄方高剂量含药血清干预的氧化损伤MC3T3-E1细胞中GSH水平有明显升高,ROS水平有明显降低。因此,我们进一步采用高剂量含药血清来观察其对p-FOXO1的干预作用。结果发现,与模型组相比,尽管(六味地黄方)高剂量含药血清组降低了FOXO1蛋白表达,但p-FOXO1表达明显高于模型组(P<0.05)。这提示六味地黄方含药血清虽然降低了氧化损伤MC3T3-E1细胞的FOXO1蛋白表达,但还是能上调FOXO1基因磷酸化水平。根据细胞实验中的结果我们推测:六味地黄方各剂量组FOXO1表达下降是由于六味地黄方改善氧化应激后,不再需要通过FOXO1高表达来改善氧化应激,因此FOXO1蛋白表达出现下降;但同时六味地黄方能促进FOXO1磷酸化,p-FOXO1发挥了部分促进细胞增殖及抗氧化的作用。

    综上,本研究发现六味地黄方能促进OVX大鼠骨形成,抑制骨吸收,改善氧化应激,抑制ROS水平,其机制可能部分与促进成骨细胞FOXO1磷酸化有关。

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