Wistar雄性大鼠40只、雌性大鼠42只，体质量200 g左右，SPF级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。动物使用许可证号：SYXK（沪）2020-0009。动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006。大鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心。动物饲养条件：湿度（55±10）%，温度（23±2）℃，昼夜交替光照与黑暗12 h︰12 h，自由进食进水。实验过程中所有操作均符合上海中医药大学实验动物伦理委员会规定（伦理批准号：PZSHUTCM190912002）。

MC3T3-E1，购自中国科学院上海细胞库。

六味地黄方药物组成、产地及煎煮方法参见文献^［

戊酸雌二醇片（补佳乐），法国DELPHARM Lille S.A.S.公司（批号：488A）；H₂O₂，上海阿拉丁生化科技股份有限公司（批号：H112515）；N-乙酰半胱氨酸（NAC），瑞阳制药有限公司（批号：19050303）；替来他明/唑拉西泮（舒泰50），法国维克有限公司（批号：83887901）；ROS检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司（批号：S0033）；还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒（批号：A006-2）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）（批号：A005）、超氧化物歧化酶（SOD）（批号：A001-3）、过氧化氢酶（CAT）（批号：A007-2）、蛋白定量试剂盒（批号：A045-3），南京建成生物工程研究所；I型胶原羧基末端肽（CTX-I）（批号：XY-E30026）、骨钙素（OCN）（批号：XY-E30604）、骨碱性磷酸酶（BALP）试剂盒（批号：XY-E30037），上海信裕生物有限公司；CCK-8试剂盒，美国Sab公司（批号：CP002）；0.25%胰蛋白酶（批号：T1300-100）、青霉素-链霉素混合液（批号：P1400-100），北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清，美国Gibco公司（批号：16000-044）；α基础培养基（α-MEM），美国HyClone公司（批号：SH30265.01）；FOXO1（批号：Bs-23175R）、p-FOXO1一抗（批号：Bs-13207R），北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔，上海碧云天生物技术有限公司（批号：A0208）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），美国 Cell Signaling Technology 公司（批号：5174）。

电转仪，大连竞迈科技有限公司（型号：PS-9）；恒温水浴箱，北京市长凤仪器仪表公司（型号：HW-SY11-K）；CO₂恒温培养箱，美国Thermo Fisher Scientific公司（型号：3111）；生物安全柜，苏州金净净化设备公司（型号：BHC-1300IIB2）；流式细胞仪，美国Beckman公司（型号：CytoFLEX）；酶标仪，美国BioTek公司（型号：Synergy H1）；离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司（型号：TDZ4-WS）；电泳仪，美国Bio-Rad公司（型号：mini protean 3 cell）；0.22 µm过滤器，美国Millipore公司（型号：SLGP033RB）；成像系统，上海天能公司（型号：5200）；超低温冰箱，美国Thermo Fisher Scientific公司（型号：900系列）。

将42只Wistar雌性大鼠分为正常组、假手术组、模型组、补佳乐组、NAC组，以及六味地黄方大剂量组及小剂量组，每组6只。除正常组外，其他大鼠用舒泰50按照40 mg·kg^-1体质量腹腔注射麻醉，肌内注射0.2 mL的阿托品。麻醉后，参照文献^［

给药周期为8周。假手术组和模型组均给予质量分数为0.9%的氯化钠溶液灌胃；按照成人每日用药量换算，六味地黄方小剂量组予7.5 g·kg^-1·d^-1六味地黄方灌胃，六味地黄方大剂量组予15 g·kg^-1·d^-1六味地黄方灌胃；补佳乐组给予0.1 mg·kg^-1·d^-1补佳乐灌胃。以上各组均每日灌胃1次。NAC组给予NAC，剂量为50 mg·kg^-1·d^-1，每天1次，皮下注射。

（1）大鼠氧化应激及骨转换标志物。取股骨骨髓，采用二氯荧光黄二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针检测ROS水平。按照试剂盒说明书检测血清中抗氧化指标，包括SOD活力以及CAT、GSH⁃PX、GSH含量。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测骨转换标志物，包括骨形成标志物BALP、OCN，骨吸收标志物CTX-I。

（2）大鼠股骨FOXO1蛋白表达。采用Western blot法检测大鼠股骨中的FOXO1蛋白表达。取大鼠股骨，加入细胞裂解液（RIPA），冰上裂解30 min后，离心收集上清提取细胞蛋白。二辛可宁酸（BCA）法测定细胞总蛋白浓度。各孔取25 µg的蛋白上样，于10％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离（浓缩胶80 V电压，20 min；分离胶120 V电压，60 min）。将分离后的蛋白电转移（100 mA电流，90 min）至聚偏二氟乙烯（PVDF膜）。加入5%脱脂奶粉封闭液于摇床上室温封闭1 h。用等渗缓冲盐溶液（TBST）洗膜3次，每次5 min，分别加入一抗抗体（体积稀释比例均为1∶1 000）4 ℃反应过夜。次日先以TBST洗膜3次，每次5 min。后加入HRP标记的抗兔IgG（体积稀释比例为1∶1 000），室温反应1 h。再用TBST洗膜3次，每次5 min。按增强化学发光（ECL）试剂盒说明进行显影。采用ImageJ 软件对蛋白条带进行灰度分析。

40只雄性Wistar大鼠随机分为4组，即对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只，分别灌胃给予质量分数为0.9%的氯化钠溶液、低剂量六味地黄方（15 g·kg^-1·d^-1）、中剂量六味地黄方（30 g·kg^-1·d^-1）和高剂量六味地黄方（45 g·kg^-1·d^-1）。按每100 g大鼠体质量1 mL给药，连续灌胃5 d，于第5天灌胃1 h后腹主动脉取血后处死。将装有大鼠血液的离心管离心，取同组血清合并，制备对照组含药血清和低、中、高剂量组含药血清，并于56 ℃水浴箱灭活30 min。将灭活后的血清通过0.22 μm Millipore过滤器过滤，分装后放入-80 ℃冰箱保存备用。

MC3T3-E1细胞复苏后，用含10%的胎牛血清、含青霉素-链霉素混合液的α-MEM培养液，于37 ℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养。细胞隔天换液，当生长至70%～80%融合时，用胰酶消化传代。取对数生长期细胞用于本实验。

①FOXO1蛋白表达：实验分为正常组、模型组、对照含药血清组，以及低、中、高剂量含药血清组、NAC组。②细胞转染及验证：分为正常组、FOXO1小干扰RNA转染组（siFOXO1组）、阴性对照小干扰RNA转染组（siNC组）。③沉默FOXO1基因后含药血清对细胞增殖及ROS水平干预作用：分为正常组、模型组、NAC组、高剂量含药血清组、siNC组、siFOXO1组、siFOXO1+高剂量含药血清组。④含药血清对p-FOXO1表达的干预作用：分为正常组、模型组、NAC组、对照含药血清组、高剂量含药血清组。

除正常组外，其余各组先用1.0 mmol·L^-1的H₂O₂预处理MC3T3-E1细胞6 h，随后模型组、siNC组、siFOXO1组更换正常培养基，NAC组更换含2.5 mmol·L^-1 NAC的培养基，对照含药血清组和高、中、低剂量含药血清组均更换为相应组别含10%大鼠血清的培养基。各组均处理24 h。

（1）FOXO1蛋白表达。参照“1.3.4”项下方法进行药物干预。FOXO1蛋白检测：将需要抽提蛋白的细胞从培养箱中取出，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞后离心收集细胞沉淀，加入RIPA提取蛋白，BCA法测定细胞蛋白浓度。其余操作参照“1.2.3（2）”项下方法。

（2）细胞转染及转染后验证。细胞转染委托上海吉玛制药技术有限公司完成。细胞转染后蛋白验证参照“1.3.5（1）”项下方法。

（3）沉默FOXO1基因后细胞增殖及ROS水平。参照“1.3.4”项下方法处理细胞。分别于培养48 h、72 h后，加入 CCK-8并放入培养箱中孵育，于450 nm处读取光密度（OD）值。采用DCFH-DA荧光探针，检测细胞内ROS水平。

（4）六味地黄方含药血清对p-FOXO1表达的干预作用。参照“1.3.4”项下方法处理细胞；参照“1.3.5（1）”项下方法检测FOXO1及p-FOXO1蛋白表达。

与假手术组比较，模型组大鼠ROS水平升高（P<0.05）。与模型组比较，补佳乐组、NAC组以及六味地黄方大、小剂量组ROS水平均明显降低（P<0.05）。补佳乐组、NAC组、六味地黄方大剂量组的ROS水平明显低于六味地黄方小剂量组（P<0.05）。见图1。

图1  各组ROS水平比较

注：  ROS为活性氧，NAC为N-乙酰半胱氨酸。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与补佳乐组比较，△P<0.05；与NAC组比较，▽P<0.05；与六味地黄方大剂量组比较，▲P<0.05。n=6，$\overline{x}$±s。

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与假手术组比较，模型组大鼠SOD、CAT、GSH-PX、GSH水平明显降低（P<0.05）。与模型组比较，补佳乐组、NAC组和六味地黄方大剂量组SOD、CAT、GSH-PX、GSH水平均明显升高（P<0.05），六味地黄方小剂量组GSH-PX明显升高（P<0.05）。与补佳乐组比较，六味地黄方大剂量组SOD水平明显降低（P<0.05），六味地黄方小剂量组SOD、CAT、GSH-PX、GSH水平均明显降低（P<0.05）。与NAC组比较，六味地黄方大剂量组SOD、GSH及六味地黄方小剂量组SOD、CAT、GSH-PX、GSH水平均明显降低（P<0.05）。与六味地黄方大剂量组比较，六味地黄方小剂量组GSH-PX水平明显降低（P<0.05）。见图2。

图2  各组抗氧化指标比较

注：  SOD为超氧化物歧化酶，CAT为过氧化氢酶，GSH-PX为谷胱甘肽过氧化物酶，GSH为还原型谷胱甘肽，NAC为N-乙酰半胱氨酸。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与补佳乐组比较，△P<0.05；与NAC组比较，▽P<0.05；与六味地黄方大剂量组比较，▲P<0.05。n=6，$\overline{x}$±s。

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与假手术组比较，模型组BALP、OCN水平明显降低，CTX-I水平明显升高（P<0.05）。与模型组比较，补佳乐组、NAC组及六味地黄方大剂量组的BALP、OCN水平均明显升高（P<0.05），CTX-I水平均明显降低（P<0.05）。与补佳乐组比较，六味地黄方小剂量组BALP水平明显降低（P<0.05）。与NAC组比较，六味地黄方小剂量组BALP水平明显降低（P<0.05），六味地黄方大剂量组、小剂量组OCN水平均明显降低（P<0.05），六味地黄方小剂量组CTX-I水平明显升高（P<0.05）。与六味地黄方大剂量组比较，六味地黄方小剂量组各指标差异均无统计学意义（P>0.05）。见图3。

图3  各组骨转换标志物水平比较

注：  BALP为骨碱性磷酸酶，OCN为骨钙素，CTX-I为Ⅰ型胶原羧基末端肽，NAC为N-乙酰半胱氨酸。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与补佳乐组比较，△P<0.05；与NAC组比较，▽P<0.05。n=6，$\overline{x}$±s。

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与假手术组比较，模型组大鼠股骨FOXO1蛋白表达明显升高（P<0.05）。与模型组比较，补佳乐组、NAC组以及六味地黄方大、小剂量组股骨FOXO1蛋白表达均明显降低（P<0.05）。与补佳乐组比较，NAC组及六味地黄方大、小剂量组股骨FOXO1蛋白表达均明显升高（P<0.05）。与NAC组比较，六味地黄方大、小剂量组股骨FOXO1蛋白表达均明显升高（P<0.05）。与六味地黄方大剂量组比较，六味地黄方小剂量组股骨FOXO1蛋白表达明显升高（P<0.05）。见图4。

图4  各组大鼠FOXO1蛋白表达比较

注：  左图为FOXO1蛋白电泳条带图，右图为FOXO1蛋白相对表达量统计图。FOXO1为叉头框蛋白O1，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，NAC为N-乙酰半胱氨酸。A为正常组，B为假手术组，C为模型组，D为补佳乐组，E为NAC组，F为六味地黄方大剂量组，G为六味地黄方小剂量组。与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与补佳乐组比较，△P<0.05；与NAC组比较，▽P<0.05；与大剂量组比较，▲P<0.05。n=6，$\overline{x}$±s。

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与正常组比较，模型组细胞FOXO1蛋白表达明显增加（P<0.05）。与模型组比较，低、中、高剂量含药血清组及NAC组FOXO1蛋白表达均明显降低（P<0.05），且随着六味地黄方剂量增加，蛋白表达依次降低（P<0.05）。与NAC组比较，低、中、高剂量含药血清组蛋白表达均明显增加（P<0.05）。见图5。

图5  各组MC3T3-E1细胞FOXO1蛋白表达比较

注：  左图为FOXO1蛋白电泳条带图，右图为FOXO1蛋白相对表达量统计图。FOXO1为叉头框蛋白O1，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，NAC为N-乙酰半胱氨酸。A为正常组，B为模型组，C为对照含药血清组，D为低剂量含药血清组，E为中剂量含药血清组，F为高剂量含药血清组，G为NAC组。与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与对照含药血清组比较，△P<0.05；与低剂量含药血清组比较，▽P<0.05；与中剂量含药血清组比较，▲P<0.05；与高剂量含药血清组比较，▼P<0.05。n=3，$\overline{x}$±s。

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沉默FOXO1基因后通过蛋白质印迹法可以发现，siFOXO1组FOXO1蛋白表达明显低于正常组及siNC组（P<0.05）。见图6。

图6  相关基因沉默后各组FOXO1蛋白表达比较

注：  左图为FOXO1蛋白电泳条带图，右图为FOXO1蛋白相对表达量统计图。FOXO1为叉头框蛋白O1，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。A为正常组，B为siNC组，C为siFOXO1组。 siNC组为阴性对照组，siFOXO1组为FOXO1转染组。与正常组比较，*P<0.05；与siNC组比较，#P<0.05。n=3，$\overline{x}$±s。

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与模型组比较，siNC组细胞增殖差异无统计学意义（P>0.05）。沉默FOXO1基因后，siFOXO1组在48 h及72 h细胞增殖均明显低于模型组和siNC组（P<0.05）。经含药血清干预后，siFOXO1+高剂量含药血清组在48 h及72 h细胞增殖均明显高于模型组和siFOXO1组（P<0.05），但都明显低于高剂量含药血清组（P<0.05）。见图7。

图7  相关基因沉默后各组细胞增殖情况比较

注：  OD为光密度，NAC为N-乙酰半胱氨酸，siNC组为阴性对照组，siFOXO1组为FOXO1转染组。与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与NAC组比较，△P<0.05；与高剂量含药血清组比较，▽P<0.05；与siNC组比较，▲P<0.05；与siFOXO1组比较，▼P<0.05。n=3，$\overline{x}$±s。

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与模型组比较，siNC组ROS水平差异无统计学意义（P>0.05）。沉默FOXO1基因后，siFOXO1组ROS水平明显高于模型组和siNC组（P<0.05）。经含药血清干预后，siFOXO1+高剂量含药血清组ROS水平明显低于模型组和siFOXO1组（P<0.05），但明显高于高剂量含药血清组（P<0.05）。见图8。

图8  相关基因沉默后各组ROS水平比较

注：  ROS为活性氧，NAC为N-乙酰半胱氨酸，siNC组为阴性对照组，siFOXO1组为FOXO1转染组。与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与高剂量含药血清组比较，▽P<0.05；与siNC组比较，▲P<0.05；与siFOXO1组比较，▼P<0.05。n=3，$\overline{x}$±s。

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FOXO1蛋白表达结果与“2.2.1”中的结果一致。但模型组p-FOXO1蛋白表达明显低于正常组（P<0.05），NAC组及高剂量含药血清组p-FOXO1/GAPDH均明显高于模型组（P<0.05）。高剂量含药血清组p-FOXO1蛋白表达明显低于NAC组（P<0.05）。见图9。

图9  各组FOXO1/GAPDH、p⁃FOXO1/GAPDH水平比较

注：  左图为FOXO1、p-FOXO1蛋白电泳条带图，中图为FOXO1蛋白相对表达量统计图，右图为p-FOXO1蛋白相对表达量统计图。FOXO1为叉头框蛋白O1，p-FOXO1为磷酸化叉头框蛋白O1，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。A为正常组，B为模型组，C为NAC组，D为对照含药血清组，E为高剂量含药血清组。与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与NAC组比较，△P<0.05；与对照含药血清组比较，▽P<0.05。n=3，$\overline{x}$±s。

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