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Mechanism of Huangqi Decoction against liver fibrosis by network pharmacological analysis combined with related cell experiment
Updated：2023-11-24
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    • Mechanism of Huangqi Decoction against liver fibrosis by network pharmacological analysis combined with related cell experiment

    • QIN Yan

      ,  

      LI Yajuan

      ,  

      WANG Qinglan

      ,  
    • Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine   Vol. 57, Issue 11, Pages: 67-76(2023)

    • DOI：10.16305/j.1007-1334.2023.2101139    

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  • QIN Yan,LI Yajuan,WANG Qinglan.Mechanism of Huangqi Decoction against liver fibrosis by network pharmacological analysis combined with related cell experiment[J].Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine,2023,57(11):67-76. DOI： 10.16305/j.1007-1334.2023.2101139.

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Abstract

Objective

To investigate the key molecular mechanism of Huangqi Decoction against liver fibrosis based on network pharmacology and hepatic stellate cells （HSC） experiment validation.

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Methods

Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP） was used to obtain all the components from Astragali Radix and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma. Then， the potential active components were screened out with the criteria of bioavailability （OB）≥30% and drug-like （DL）≥0.18； Meanwhile， more potential active components were acquired by Chemsrc database and literature. The targets of chemical components， also called drug targets， were obtained through TCMSP database， Swisstarget prediction database and DrugBank. Then the targets of hepatic fibrosis， also called disease targets， were obtained through Gencards， OMIM. The potential targets of anti-hepatic fibrosis of Huangqi Decoction were obtained by the intersection of drug targets and disease targets. The signal pathway of Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome （KEGG） was analyzed by enrichment analysis （Metascape） platform， and the key signal pathways of Huangqi Decoction were obtained， and the network map of “Huangqi Decoction anti-hepatic fibrosis target-signal pathway” was constructed by Cytoscape 3.8.1 software. Finally， the effects of Huangqi Decoction on the activation and key signal pathways of LX-2 cells were verified by human hepatic stellate cell LX-2 in vitro.

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Results

A total of 153 potential targets of Huangqi Decoction against liver fibrosis were screened by network pharmacological analysis. The analysis of KEGG signal pathway suggests that the above targets may be closely related to interleukin-17 （IL-17） signal pathway， phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B （PI3K-Akt） signal pathway and 5-adenosine monophosphate-dependent protein kinase （AMPK） signal pathway. PI3K-Akt signaling pathway plays an important role in the occurrence and development of liver fibrosis， especially in HSC activation. In vitro， Huangqi Decoction could down-regulate the gene and protein expression of α-smooth muscle actin （α-SMA） and type Ⅰ collagen （Col-Ⅰ） in human hepatic stellate cell line LX-2 cells， and inhibit cell activation. Further study showed that Huangqi Decoction could significantly inhibit the expression of PI3K gene and protein in LX-2 cells， and down-regulate the phosphorylation level of Akt， suggesting that it could inhibit the PI3K-Akt signal pathway.

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Conclusion

Network pharmacology combined with cell experiment suggests that part of the mechanism of Huangqi Decoction in anti-hepatic fibrosis is related to down-regulating PI3K-Akt signal pathway and inhibiting the activation of hepatic stellate cells.

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Keywords

hepatic fibrosis; Huangqi Decoction; network pharmacology; hepatic stellate cells; mechanism of action; traditional Chinese herbal medicine research

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肝纤维化是肝脏对多种慢性损伤的一种修复愈合反应，以肝组织内细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度增生与异常沉积为特征，是多种慢性肝病的重要病理特点，也是慢性肝病向肝硬化发展的必经过程。肝硬化是肝纤维化的末期，进而可能发展为肝癌。据估计，肝纤维化影响全球人口的1％至2％，并导致全世界每年超过100万人死亡［

1-3］。现代医学除针对某些病因的治疗外，目前尚缺乏理想的生物或化学临床治疗药物。中医药在肝纤维化的治疗上具有明显的优势。
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黄芪汤始载于《太平惠民和剂局方》，黄芪与甘草剂量比例为6∶1，故又名黄芪六一汤。方中黄芪甘温，大补肺脾之气，固表止汗，托毒生肌，补气以生血，补气以生津液，为君药。炙甘草补脾益气和中，助黄芪益气补虚之力，为臣佐药。两药配伍，甘以守中，补中益气之力增，气血津液化生有源，则气弱血虚所致诸症自愈，是经典补气药方之一［

4］。研究发现，黄芪汤对四氯化碳（CCl4）、胆管结扎（BDL）及二甲基亚硝胺（DMN）［5］等不同因素诱导的实验性肝纤维化模型均具有良好的预防及治疗作用［6-7］，其作用机制值得进一步研究。
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网络药理学可从整体角度研究药物的作用机制，适合于分析中药复方多成分、多靶点的作用特点。本研究首先采用网络药理学方法初步发现黄芪汤抗肝纤维化的作用靶点并对靶点进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路分析，获得黄芪汤成分调控的关键信号通路，并构建“靶点-信号通路”网络图。肝星状细胞活化是肝纤维化的主要细胞学基础，本研究进一步采用人肝星状细胞系人肝星状细胞LX-2（简称“LX-2细胞”），基于网络药理学结果进一步采用细胞实验验证黄芪汤抗肝纤维化的作用机制。

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1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

LX-2细胞株，由上海中医药大学肝病研究所徐列明教授赠送。

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1.1.2 药物与试剂

黄芪汤（黄芪、甘草）由上海中医药大学附属曙光医院国家中医药管理局中药制剂中心（国家中医药管理局三级实验室）制成粗粉末，水煎，浓缩煎出液制成流浸膏后真空干燥，-20 ℃冷藏保存。生药总质量为8.0 kg，煎煮浓缩后为1.115 kg，真空干燥后质量为1.52 kg，每克含生药5.263 g。

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含各种氨基酸和葡萄糖的培养基（DMEM），美国HyClone公司（批号：AE29040273）；互补脱氧核糖核酸合成试剂盒（iScriptTM cDNA Synthesis Kit）、荧光染料定量PCR 试剂（iTaqTM Universal SYBR® Green Supermix），美国Bio-Rad公司（批号分别为1708891、1725122）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、兔单克隆抗体、蛋白激酶B（Akt）1/2/3 兔单克隆抗体，碧云天生物技术有限公司（批号分别为AF0006、AF1186、AF1789）；抗Akt磷酸化T308（phospho T308）抗体，美国Abcam公司（批号：ab38449）；抗磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抗体、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体、I型胶原蛋白（Col-I）抗体，均购自美国Cell Signaling Technology公司（批号分别为4255S、19245S、72026S）。

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1.1.3 仪器

脱色摇床，其林贝尔仪器制造有限公司（型号：TS8）；制冰机，日本Sanyo株式会社（型号：SIM-F140AY65）；恒温微孔板快速振荡器，其林贝尔仪器制造有限公司（型号：QB-9006）；恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司（型号：S23-2）；电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司（型号：AL204）；PCR扩增仪，德国Biometra公司（型号：Thermocycler）；低温高速离心机，美国Eppendorf公司（型号：5425）；实时荧光定量PCR，美国ABI公司（型号：7500Fast）；酶标仪，美国Molecular Devices公司（型号：Spectramax 190）；超净台，美国Labconco公司（型号：3612524）；蛋白质电泳及转印系统/核酸蛋白测定仪，美国Bio-Rad公司（型号：turbo1704150）；化学发光显影仪，上海天能科技有限公司（型号：Tanon5200）。

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1.2 黄芪汤抗肝纤维化网络药理学分子分析结合细胞实验验证研究思路

本研究首先通过中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、化源网（Chemsrc）数据库（https：//www.chemsrc.com/）以及检索文献获得所有的黄芪汤的活性成分。通过TCMSP、化合物靶点预测（Swisstarget prediction）数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch）、药物银行（DrugBank）数据库（https：//www.drugbank.ca）获得化学成分的作用靶点，即药物靶点；再通过全基因（Gencards）数据库（https：//www.genecards.org）、在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库（http：//www.omim.org）等获取肝纤维化的主要靶点，即疾病靶点。取上述交集获得黄芪汤抗肝纤维化的潜在靶点；利用富集分析（Metascape）数据库（http：//metascape.org/gp/index.html）进行KEGG通路富集分析，获得黄芪汤抗肝纤维化关键信号通路；最后采用LX-2细胞验证黄芪汤对上述关键信号通路的影响，阐述黄芪汤抗肝纤维化的部分作用机制。本研究思路见图1。

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图1  网络药理学结合细胞实验验证探讨黄芪汤抗肝纤维化作用机制研究思路图

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1.3 黄芪汤抗肝纤维化网络药理学分子分析

1.3.1 黄芪汤化学成分及有效靶点的筛选

通过TCMSP、Chemsrc确定黄芪、甘草的化学成分，根据口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18两个药代动力学（ADME）属性值进行活性成分初步筛选以获得活性化合物及其作用靶点，再根据Swisstarget prediction、DrugBank数据库和已发表的文献报道补充未预测到的活性化合物的已知靶点。筛选结束后，将蛋白质靶点信息统一在通用蛋白质（Uniprot）数据库（https：//www.uniprot.org）将化合物作用的蛋白质靶点进行规范。

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1.3.2 肝纤维化相关疾病靶点筛选

以“hepatic fibrosis”“liver fibrosis”为关键词，采用Gencards数据库（https：//www.genecards.org）、OMIM数据库（http：//www.omim.org）挖掘影响肝纤维化的潜在靶点。在Genecards数据库中筛选出评分（Score）值相对较高的靶点，其分值越高表示与疾病的联系越密切。根据一般方法经验筛选Score大于两倍中位数的目标靶点为肝纤维化的潜在靶点，在Genecards数据库中所得肝纤维化靶点Score最大值为129.16，最小值为0.12，两倍中位数为8.4，故设定Score>8.4的靶点为肝纤维化的潜在靶点。最后合并4个疾病数据库筛选出的靶点作为肝纤维化的疾病靶点。

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1.3.3 黄芪汤抗肝纤维化潜在靶点的筛选

利用韦恩图（http：//www.bioinformatics.com.cn）获得药物靶点和疾病靶点的交集，即为黄芪汤抗肝纤维化的潜在靶点。

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1.3.4 生物学功能与通路的富集分析

Metascape数据库（http：//metascape.org/gp/index.html）是一个具有较为全面的注释功能和定时更新基因注释的数据库。将黄芪汤抗肝纤维化的潜在靶点输入Metascape数据库平台，选择“人”（Homo sapiens，Human），设置P<0.01，最小计数为3和富集因子>1.5（富集因子是观察到的计数与偶然预期的计数之间的比率）来进行KEGG富集分析，保存数据结果并采用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）对数据进行可视化，得到黄芪汤抗肝纤维化靶点所富集的信号通路。

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1.3.5 黄芪汤抗肝纤维化潜在靶点-信号通路网络图的构建

运用CytoScape 3.8.1软件，根据筛选出来的黄芪汤抑制肝纤维化潜在靶点和KEGG分析结果，构建肝纤维化靶点-信号通路网络图。

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1.4 黄芪汤对LX-2细胞活化及关键信号通路的影响

1.4.1 细胞培养

LX-2细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，置于5% CO2的37 ℃细胞培养箱中培养，待细胞长至亚单层后用于实验。

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1.4.2 分组与干预

LX-2细胞，设置正常对照组（control）、黄芪汤低剂量组（25 mg/L）、黄芪汤高剂量组（50 mg/L），给药后培养24 h，按检测指标要求收集细胞，每组设3个复孔，每个实验重复3次。

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1.4.3 Western blot法检测α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表达情况

每个培养皿用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗两遍后，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液150 μL ，按照二喹啉甲酸（BCA）法检测总蛋白含量。取20 µg总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经硝酸纤维素膜转移，室温封闭（5%脱脂奶粉，1 h）后，分别与特异性一抗孵育，洗涤，再孵育相应二抗（摇床室温1 h），洗涤后增强型化学发光试剂（ECL）化学发光，胶片曝光，图像分析仪通过光密度测定法定量测量。

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1.4.4 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-q PCR）检测细胞内基因表达情况

采用RT-qPCR法检测LX-2细胞纤维化相关mRNA的表达，分别为α平滑肌肌动蛋白基因（α-SMA），Ⅰ型胶原蛋白基因（Col-Ⅰ），磷脂酰肌醇-3-激酶基因（PI3K）。用TRIzol试剂提取总RNA，测定其浓度。逆转录为10 μL体系，根据试剂说明书操作，轻柔混匀后按照条件进行逆转录。反应条件：25 ℃、5 min；46 ℃、20 min；95 ℃、1 min；4 ℃保存，-20 ℃储存备用。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本实验中所用引物序列见表1。反应体系为10 μL体系。反应条件：预变性，95 ℃、30 s，1个循环；PCR反应，95 ℃、15 s，40个循环，50 ℃、60 s，40个循环。以18s作为内参，所有反应体系均为2个复孔。

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表1  引物序列
基因引物序列引物长度/bp
α-SMA 上游：5'-AAAAGACAGCTACGTGGGTGA-3' 21
下游：5'-GCCATGTTCTATCGGGTACTTC-3' 22
Col-I 上游：5'-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3' 21
下游：5'-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3' 21
PI3K 上游：5'-TATTTGGACTTTGCGACAAGACT-3' 23
下游：5'-TCGAACGTACTGGTCTGGATAG-3' 22
18s 上游：5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3' 20
下游：5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3' 20

注：  α⁃SMA为α平滑肌肌动蛋白基因，Col⁃Ⅰ为Ⅰ型胶原蛋白基因，PI3K为磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶基因，18s为核糖体小亚基基因。

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1.5 统计学方法

实验数据采用GraphPad Prism6.02软件进行分析。计量资料用ˉx±s表示，多组间比较采用one-way ANOVA进行统计分析，应用Tukey's multiple comparisons test进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

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2 结果

2.1 黄芪汤中化学成分的筛选

黄芪汤由黄芪、甘草组成，在TCMSP数据库中检索到黄芪成分87个，甘草成分280个，共367个成分。设定筛选参数为OB≥30%、DL≥0.18，获取黄芪成分20个、甘草成分92个，共112个有效成分。根据文献以及靶点一一对应，最终筛选出21个黄芪有效成分、92个甘草有效成分，共同成分3个。见表2。

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表2  黄芪汤主要化学成分
序号分子名称OB/%DL
A1 槲皮素（quercetin） 46.43 0.28
B1 毛蕊异黄酮（calycosin） 47.75 0.24
C1 山柰酚（kaempferol） 41.88 0.24
HQ1 （3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R）-10,13-二甲基-17-［（2R,5S）-5-丙-2-基-2-基］-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊烷［a］菲-3-醇｛（3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-［（2R,5S）-5-propan-2-yloctan-2-yl］-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta［a］phenanthren-3-ol｝ 36.23 0.78
HQ10 联苯双酯（bifendate） 31.10 0.67
HQ11 刺芒柄花素（formononetin） 69.67 0.21
HQ12 黄芪甲苷 Ⅳ（astragaloside） 22.50 0.15
HQ13 黄芪甲苷A（astragaloside） 17.74 0.15
HQ14 氟乙脒（FA） 68.96 0.71
HQ15 黄芪异黄烷苷（isomucronulatol-7,2'-di-O-glucosiole） 49.28 0.62
HQ16 1，7-二羟基-3，9-二甲氧基翼状碳烯（1,7-dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene） 39.05 0.48
HQ17 黄芪多糖［2-（chloromethyl）-4-（4-nitrophenyl）-1,3-thiazole］ - -
HQ18 黄芪总皂苷（astragaloside） - -
HQ2 白桦脂酸（mairin） 55.38 0.78
HQ3 华良姜素（jaranol） 50.83 0.29
HQ4 常春藤皂苷元（hederagenin） 36.91 0.75
HQ5 异鼠李素（isorhamnetin） 49.60 0.31
HQ6 3,9-二-O-甲基尼索啉（3,9-di-O-methylnissolin） 53.74 0.48
HQ7 7-O-甲基异琥珀酸醇（7-O-methylisomucronulatol） 74.69 0.30
HQ8 9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷（9,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside） 36.74 0.92
HQ9 （6αR,11αR）-9,10-二甲氧基-6α,11α-二氢-6H-苯并呋喃并［3,2-c］铬-3-醇｛（6αR,11αR）-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano［3,2-c］chromen-3-ol）｝ 64.26 0.42
GC1 α-D-甲基3-脱氧-3-（苯偶氮）-4,6-O-（苯亚甲基）-（9CI）吡喃葡萄糖（mairin） 55.38 0.78
GC10 甘草酚（glycyrol） 90.78 0.67
GC11 异美迪紫檀素（medicarpin） 49.22 0.34
GC12 黄羽扇豆魏特酮（lupiwighteone） 51.64 0.37
GC13 7-甲氧基-2-甲基异黄酮（7-methoxy-2-methyl） 42.56 0.20
GC14 柚皮素（naringenin） 59.29 0.21
GC15 甘草次酸（α型）（glycyrrhetinic acid） 22.05 0.74
GC16 （2S）-2-［4-羟基-3-（3-甲基丁烯基）苯基］-8,8-二甲基-2,3-二氢吡喃［2,3-f］色酮-4-酮｛（2S）-2-［4-hydroxy-3-（3-methylbut-2-enyl）phenyl］-8,8-dimethyl-2,3-dihydropyrano［2,3-f］chromen-4-one）｝ 31.79 0.72
GC17 欧芹酮（euchrenone） 30.29 0.57
GC18 粗毛甘草素B（glyasperin B） 65.22 0.44
GC19 粗毛甘草素F（glyasperin F） 75.84 0.54
GC2 华良姜素（jaranol） 50.83 0.29
GC20 粗毛甘草素C（glyasperin C） 45.56 0.40
GC21 异三醇（isotrifoliol） 31.94 0.42
GC22 （E）-1-（2,4-二羟基苯基）-3-（2,2-二甲基铬-6-基）丙-2-烯-1-酮｛（E）-1-（2,4-dihydroxyphenyl）-3-（2,2-dimethylchromen-6-yl）prop-2-en-1-one｝ 39.62 0.35
GC23 甘草黄酮W（kanzonols W） 50.48 0.52
GC24 （2S）-6-（2,4-二羟基苯基）-2-（2-羟基丙-2-基）-4-甲氧基-2,3-二氢呋喃［3,2-g］铬-7-酮｛（2S）-6-（2,4-dihydroxyphenyl）-2-（2-hydroxypropan-2-yl）-4-methoxy-2,3-dihydrofuro［3,2-g］chromen-7-one｝ 60.25 0.63
GC25 半甘草异黄酮B（semilicoisoflavone B） 48.78 0.55
GC26 鳞叶甘草素A（glepidotin A） 44.72 0.35
GC27 鳞叶甘草素B（glepidotin B） 64.46 0.34
GC28 菜豆异黄素（phaseolinisoflavan） 32.01 0.45
GC29 刺果甘草查尔酮（glypallichalcone） 61.60 0.19
GC3 异鼠李素（isorhamnetin） 49.60 0.31
GC30 8-（6-羟基-2-苯并呋喃基）-2,2-二甲基-5-甲酚｛8-（6-hydroxy-2-benzofuranyl）-2,2-dimethyl-5-chromenol｝ 58.44 0.38
GC31 甘草查尔酮B（Licochalcone B） 76.76 0.19
GC32 甘草查尔酮G（Licochalcone G） 49.25 0.32
GC33 3-（2,4-二羟基苯基）-8-（1,1二甲基丙烯-2-烯基）-7-羟基-5-甲氧基香豆素｛3-（2,4-dihydroxyphenyl）-8-（1,1-dimethylprop-2-enyl）-7-hydroxy-5-methoxy-coumarin｝ 59.62 0.43
GC34 甘草利酮（licoricone） 63.58 0.47
GC35 甘草宁A（gancaonin A） 51.08 0.40
GC36 甘草宁B（gancaonin B） 48.79 0.45
GC37 3-（3,4-二羟基苯基）-5,7-二羟基-8-（3-甲基丁烯基）色酮｛3-（3,4-dihydroxyphenyl）-5,7-dihydroxy-8-（3-methylbut-2-enyl）chromone｝ 66.37 0.41
GC38 5,7-二羟基-3-（4-甲氧基苯基）-8-（3-甲基丁烯基）色酮｛5,7-dihydroxy-3-（4-methoxyphenyl）-8-（3-methylbut-2-enyl）chromone｝ 30.49 0.41
GC39 2-（3,4-二羟苯基）-5,7-二羟-6-（3-甲基丁烯基）色酮｛2-（3,4-dihydroxyphenyl）-5,7-dihydroxy-6-（3-methylbut-2-enyl）chromone｝ 44.15 0.41
GC4 豆甾醇（sitosterol） 36.91 0.75
GC40 甘氨酸（glycyrin） 52.61 0.47
GC41 地衣酮（licocoumarone） 33.21 0.36
GC42 甘草异黄酮（licoisoflavone） 41.61 0.42
GC43 甘草异黄酮B（licoisoflavone B） 38.93 0.55
GC44 甘草异黄酮A（licoisoflavone A） 52.47 0.54
GC45 金翅果芸香碱（shinpterocarpin） 80.30 0.73
GC46 （E）-3-［3,4-二羟基-5-（3-甲基丁烯基）苯基］-1-（2,4-二羟基苯基）丙-2-烯-1-酮｛（E）-3-［3,4-dihydroxy-5-（3-methylbut-2-enyl）phenyl］-1-（2,4-dihydroxyphenyl）prop-2-en-1-one｝ 46.27 0.31
GC47 新甘草苷（liquiritin） 65.69 0.74
GC48 甘草吡喃香豆素（licopyranocoumarin） 80.36 0.65
GC49 葛兰素（glyzaglabrin） 61.07 0.35
GC5 刺芒柄花素（formononetin） 69.67 0.21
GC50 光甘草定（glabridin） 53.25 0.47
GC51 光甘草宁（glabranin） 52.90 0.31
GC52 光甘草素（glabrene） 46.27 0.44
GC53 光甘草酮（glabrone） 52.51 0.50
GC54 1,3-二羟基-9-甲氧基-6-苯并呋喃并［3,2-c］色酮｛1,3-dihydroxy-9-methoxy-6-benzofurano［3,2-c］chromenone｝ 48.14 0.43
GC55 1,3-二羟基-8,9-二甲氧基-6-苯并呋喃［3,2-c］色酮｛1,3-dihydroxy-8,9-dimethoxy-6-benzofurano［3,2-c］chromenone｝ 62.90 0.53
GC56 黄甘草异黄酮A（eurycarpin A） 43.28 0.37
GC57 （-）-中果皮碱［（-）-medicocarpin］ 40.99 0.95
GC58 乌拉尔宁（sigmoidin-B） 34.88 0.41
GC59 （2R）-7-羟基-2-（4-羟基苯基）色满-4-酮｛（2R）-7-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one｝ 71.12 0.18
GC6 甘草酮a（licochalcone a） 40.79 0.29
GC60 （2S）-7-羟基-2-（4-羟基苯基）-8-（3-甲基丁烯基）色胺-4-酮｛（2S）-7-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）-8-（3-methylbut-2-enyl）chroman-4-one｝ 36.57 0.32
GC61 异甘草醇（isoglycyrol） 44.70 0.84
GC62 异甘草酚（isolicoflavonol） 45.17 0.42
GC63 母乳低聚糖（HMO） 38.37 0.21
GC64 1-甲氧基菜豆素（1-methoxyphaseollidin） 69.98 0.64
GC65 槲皮素二聚体（quercetin der.） 46.45 0.33
GC66 3'-羟基-4'-O-甲基苯胺（3'-hydroxy-4'-O-Methylglabridin） 43.71 0.57
GC67 3'-甲氧基光甘草定（3'-methoxyglabridin） 46.16 0.57
GC68 2-［（3R）-8,8-二甲基-3,4-二氢-2H-吡喃［6,5-f］铬-3-基］-5-甲氧基苯酚｛2-［（3R）-8,8-dimethyl-3,4-dihydro-2H-pyrano［6,5-f］chromen-3-yl］-5-methoxyphenol｝ 36.21 0.52
GC69 炎性香豆素A（inflacoumarin A） 39.71 0.33
GC7 驴食草酚（vestitol） 74.66 0.21
GC70 顺式-5-二十碳烯酸（icos-5-enoic acid） 30.70 0.20
GC71 甘草黄酮F（kanzonol F） 32.47 0.89
GC72 6-戊烯基癸基（6-prenylated eriodictyol） 39.22 0.41
GC73 7,2',4'-三羟基-5-甲氧基-3-芳基香豆素（7,2',4'-trihydroxy-5-methoxy-3-arylcoumarin） 83.71 0.27
GC74 7-乙酰氧基-2-甲基异黄酮（7-acetoxy-2-methylisoflavone） 38.92 0.26
GC75 8-戊烯基癸基（8-prenylated eriodictyol） 53.79 0.40
GC76 钆酸（gadelaidic acid） 30.70 0.20
GC77 甘草宁G（gancaonin G） 60.44 0.39
GC78 甘草宁H（gancaonin H） 50.10 0.78
GC79 利考果皮素（licoagrocarpin） 58.81 0.58
GC8 高丽槐素（inermine） 75.18 0.54
GC80 粗毛甘草素M（glyasperins M） 72.67 0.59
GC81 甘草黄酮醇A（glycyrrhiza flavonol A） 41.28 0.60
GC82 地衣异黄酮（licoagroisoflavone） 57.28 0.49
GC83 芳香膜菊素（odoratin） 49.95 0.30
GC84 菜豆素（phaseol） 78.77 0.58
GC85 2-（2,2-二甲基-2H-铬-6-基）-8,8-二甲基-2,3-二氢-8H-吡喃［2,3-f］铬-4-酮（xambioona） 54.85 0.87
GC86 脱氢酶C（dehydroglyasperins C） 53.82 0.37
GC9 戊酸二氟米松（DFV） 32.76 0.18

注：  A1、B1、C1代表黄芪和甘草共同拥有的3个成分，HQ1⁃HQ18代表黄芪中的主要成分，GC1-GC86代表甘草中的主要成分。OB为口服生物利用度，DL为药物相似性。

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2.2 黄芪汤抗肝纤维化潜在靶点的筛选

首先通过TCMSP数据库预测黄芪汤中化合物的靶点，Swisstarget prediction数据库再筛选做补充，最后为了标准化蛋白质靶点信息，统一在Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）中将蛋白质靶点进行规范。黄芪成分中筛选出253个靶点，甘草成分中筛选出226个靶点，合并后删除重复值，共得到282个靶点。

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通过Genecards数据库，根据一般经验筛选获得肝纤维化靶点1 643个。结合OMIM数据库补充相关靶点，合并后删除重复值，最终得到1 689个与肝纤维化相关靶点。

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将上述化合物靶点和疾病靶点通过微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）取交集，绘制出韦恩（VENN）图［

8］，共筛选出153个黄芪汤成分抗肝纤维化的潜在作用靶点。见图2。
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图2  黄芪汤和肝纤维化靶点韦恩图

注：  交集部分为黄芪汤抗肝纤维化的潜在靶点。

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2.3 黄芪汤成分-疾病靶点交集信号通路分析

应用Metascape数据库对黄芪汤抑制肝纤维化相关靶点进行信号通路分析，借助Origin Lab 2018对结果可视化。KEGG 富集分析结果显示，核心靶点与癌症途径、乙型肝炎、晚期糖基化终末产物（AGEs）-糖基化终末产物受体（RAGE）信号通路、癌症中的蛋白多糖白介素-17（IL-17）信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、5'-单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（AMPK）信号通路、分泌型糖蛋白Wnt信号通路等密切相关。见图3。

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图3  黄芪汤成分⁃疾病靶点京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析图

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2.4 黄芪汤抗肝纤维化潜在靶点⁃信号通路网络图的构建

运用CytoScape 3.8.1构建黄芪汤抗肝纤维化靶点-通路网络，得到黄芪和甘草成分与肝纤维化交集靶点以及核心通路网络。见图4。

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图4  黄芪汤抗肝纤维化核心靶点-关键通路网络图

注：  蓝色菱形为黄芪汤抗肝纤维化核心靶点，橘色箭头为黄芪汤抗肝纤维化核心通路。节点面积代表其度值，面积越大表示该节点越重要。

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2.5 黄芪汤对LX-2细胞活化的影响

体外研究黄芪汤对LX-2细胞活化的影响，结果发现，与正常对照组比较，黄芪汤高、低剂量组均可显著下调LX-2细胞α-SMA、Col-Ⅰ蛋白和mRNA表达（P<0.05），提示黄芪汤可体外抑制HSC的活化及胶原生成。见图5。

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图5  黄芪汤对LX-2细胞活化的影响

注：  图A、D为蛋白表达条带图，图B、E为蛋白表达半定量分析结果，图C、F为基因表达变化。α-SMA为α平滑肌肌动蛋白，Col-Ⅰ为Ⅰ型胶原蛋白，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。HQT为黄芪汤，control为正常对照组，25 mg/L为黄芪汤低剂量组，50 mg/L为黄芪汤高剂量组。与control组比较，*P<0.05；n=3，ˉx±s。

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2.6 黄芪汤对LX-2细胞PI3K-Akt信号通路的影响

体外研究黄芪汤对LX-2细胞PI3K-Akt信号通路的影响，结果发现，与正常对照组比较，黄芪汤高、低剂量组可显著下调LX-2细胞PI3K蛋白及mRNA表达，黄芪汤高、低剂量组可显著抑制Akt蛋白磷酸化（P<0.05），提示黄芪汤可体外抑制PI3K/Akt信号通路。见图6。

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图6  黄芪汤对LX-2细胞中PI3K/Akt通路的影响

注：  图A、D为蛋白表达条带图，图B、E为蛋白表达半定量分析结果，图C为基因表达变化。PI3K为磷脂酰肌醇-3-激酶，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，p-Akt为磷酸化蛋白激酶B，Akt为蛋白激酶B。HQT为黄芪汤，control为正常对照组，25 mg/L为黄芪汤低剂量组，50 mg/L为黄芪汤高剂量组。与control组比较，*P<0.05；n=3，ˉx±s。

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3 讨论

肝纤维化是一种病理性病变，其特征是胞外基质（ECM）在窦周间隙中逐渐积累，是多种慢性肝病的共同病理环节［

9］。如果未得到适当及时的干预，肝纤维化可进一步发展为肝硬化，而肝硬化是全世界最常见的致死性疾病之一［10］。HSC的活化在肝纤维化的进展中起着核心作用，减慢肝损伤中活化HSC的增殖是解决和治疗肝纤维化的重要策略［11］。
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黄芪汤由黄芪、甘草组成，现代药理研究［

12］发现其主要有效成分为黄芪皂苷、黄芪多糖等，具有调节免疫、促进机体代谢、抗菌等作用。动物实验研究［13-16］发现其可以改善二甲基亚硝胺（DMN）模型大鼠肝纤维化，改善肝组织病理，降低肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量，提高肝组织SOD活性，进而提高抗氧化应激效应。黄芪和甘草等均可以通过抑制HSC活化、减少胶原形成［13，17］等起到抗肝纤维化的作用。黄芪汤抗肝纤维化的作用明确，但其作用机制仍不清楚。网络药理学从整体角度出发，通过药物、靶点、疾病之间的关系分析揭示药物的作用机制，非常适合研究中药复方多成分、多靶点的作用，为中药复方的研究提供了新的思路，因此本研究基于网络药理学结合体外细胞实验进一步探讨黄芪汤抗肝纤维化的作用机制。
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本研究首先基于网络药理学预测出黄芪汤抗肝纤维化的潜在靶点及机制，并进一步通过KEGG信号通路分析，发现黄芪汤与IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K/Akt信号通路、AMPK信号通路、Wnt信号通路等密切相关；而这些与癌症途径、乙型肝炎、癌症中的蛋白多糖、利什曼病、铂类耐药、麻疹、癌症中的转录失调、甲状腺癌、朊病毒病、细胞色素P450对外源物质的代谢作用等密切相关［

18-23］。其中PI3K/Akt信号通路与肝纤维化的发展密切相关。PI3K是与胞内信号传导相关的第二信使，由p85调节亚基和p110催化亚基构成的异二聚体，具有磷脂酰肌醇激酶和丝/苏氨酸激酶双重活性［24］。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶之一的Akt是PI3K下游的重要靶基酶。肝纤维化中TGF-β、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子及瘦素等可通过自分泌或旁分泌的方式对PI3K/Akt通路产生影响。PI3K诱导的Akt活化可促进HSC增殖活化［25］。网络药理学分析提示，黄芪汤对PI3K/Akt信号通路具有调节作用，因此本研究进一步采用体外细胞实验验证黄芪汤对PI3K/Akt信号通路的影响。
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LX-2细胞是一种体外自活化的肝星状细胞。本研究以黄芪汤干预LX-2细胞，结果发现黄芪汤可抑制HSC活化标志物α-SMA水平，降低Col-Ⅰ的表达，提示黄芪汤可抑制LX-2细胞活化。进一步观察黄芪汤对PI3K/Akt信号通路的影响，结果发现黄芪汤可抑制LX-2细胞PI3K表达，下调Akt磷酸化水平。以上结果表明抑制PI3K/Akt信号通路、抑制HSC活化可能是黄芪汤抗肝纤维的部分作用机制。

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综上所述，本研究通过网络药理学分析，发现黄芪汤抗肝纤维化具有多成分、多靶点、多信号通路特点。其中PI3K/Akt信号通路可通过活化HSC，在肝纤维化发生发展中起重要作用。体外实验验证黄芪汤可通过调控PI3K/Akt信号通路抑制HSC的活化，从而起到抗肝纤维化的作用，这为发掘黄芪汤潜在作用机制提供了新的研究方向。

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